[发明专利]高通量的多年生黑麦草农杆菌转化体系及其专用试剂盒

摘要

本发明公开了一种高通量的多年生黑麦草(Lolium perenne L.)农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化体系，包括其专用试剂盒和转化方法。专用试剂盒包括发芽培养基、诱导培养基I、II、分化培养基、保持培养基、侵染液、共培养基、筛选培养基I、II、再生培养基和生根培养基。转化方法包括利用黑麦草丛生芽分生组织诱导的胚性愈伤作为外植体，经过农杆菌转化、筛选、再生和生根培养获得多年生黑麦草的转基因植株，本发明平均转化效率为8.5％，PCR阳性率超过90％。且本发明可持续、稳定、高通量的提供外植体，为黑麦草遗传改良的产业化进行提供了可行途径，具有广阔的应用前景。

主权项

一种用于多年生黑麦草农杆菌转化的专用试剂盒，其特征在于，包括发芽培养基、诱导培养基I、诱导培养基II、分化培养基、保持培养基、侵染液、共培养基、筛选培养基I、筛选培养基II、再生培养基和生根培养基；所述发芽培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为30g/L的蔗糖和3g/L凝固剂；所述诱导培养基I为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为22.6μM的2,4‑二氯苯氧乙酸、30g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；所述诱导培养基II为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9μM的2,4‑二氯苯氧乙酸、0.44μM的6‑苄氨基腺嘌呤、30g/L蔗糖和3g/L的凝固剂；所述分化培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为4.4μM的6‑苄氨基腺嘌呤、30g/L麦芽糖和3g/L的凝固剂；所述保持培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为8.8μM的6‑苄氨基腺嘌呤、30g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；所述侵染液为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为10g/L的葡萄糖和50g/L的蔗糖；所述共培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9μM的2,4‑二氯苯氧乙酸、0.44μM的6‑苄氨基腺嘌呤、400μM的乙酰丁香酮、10g/L的葡萄糖、70g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；所述筛选培养基I为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9μM的2,4‑二氯苯氧乙酸、0.44μM的6‑苄氨基腺嘌呤、50mg/L的潮霉素、200mg/L的特美汀、30g/L蔗糖的和3g/L的凝固剂；所述筛选培养基II为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为9μM的2,4‑二氯苯氧乙酸、0.44μM的6‑苄氨基腺嘌呤、75mg/L的潮霉素、200mg/L的特美汀、30g/L的蔗糖和3g/L的凝固剂；所述再生培养基为MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为4.4μM的6‑苄氨基腺嘌呤、25mg/L的潮霉素、200mg/L的特美汀、30g/L的麦芽糖和3g/L的凝固剂；所述生根培养基为1/2MS基本培养基，并在所述MS基本培养基中添加最终浓度为30g/L的蔗糖和3g/的L凝固剂。