[发明专利]一种沉默DF‑1细胞系中IFNAR2基因的方法

摘要

本发明公开了一种沉默DF‑1细胞系中IFNAR2基因的方法。它首先根据IFNAR2基因，设计RNA干扰靶点序列的多个siRNA，进一步筛选出mRNA水平上敲低IFNAR2基因表达的siRNA；再构建含有IFNAR2 RNAi基因的慢病毒载体；通过上述慢病毒载体，将IFNAR2RNAi基因介导入DF‑1细胞系，沉默IFNAR2基因的表达，提高禽流感病毒在DF‑1细胞系中的增殖滴度。此方法可提高禽流感病毒在DF‑1细胞系中的抗原量达5‑10倍，大大降低疫苗生产成本，不仅能解决疫苗抗原量不足以及生产成本较高的问题，而且推动禽流感生物反应器细胞培养技术的研发进程。

主权项

一种沉默DF‑1细胞系中IFNAR2基因的方法，其特征是，(1)根据IFNAR2基因，设计RNA干扰靶点序列的多个siRNA，进一步筛选出mRNA水平上敲低IFNAR2基因表达的siRNA，筛选得到的siRNA的DNA序列为5′‑TA CACAAGGCGTGATATCGTA‑3′；(2)构建表达上述筛选的IFNAR2基因siRNA的慢病毒载体LV‑IFNAR2‑RNAi；所述慢病毒载体为LV‑IFNAR2‑RNAi的构建方法为：1)根据筛选的siRNA的DNA序列设计合成单链DNA oligo，退火配对产生双链，再通过两端所含的酶切位点直接连入酶切后的RNAi慢病毒载体GV248中，将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，PCR方法鉴定阳性重组质粒GV248‑IFNAR2；所述双链为：IFNAR2‑RNAi‑1：5′‑CCGG TACACAAGGCGTGATATCGTA CTCGAG TACGATATCACGCCTTGTGTA TTTTTG‑3′；IFNAR2‑RNAi‑2：5′‑AATTCAAAAA TACACAAGGCGTGATATCGTA CTCGAG TACGATATCACGCCTTGTGTA‑3′；2)大量提取重组质粒GV248‑IFNAR2，与辅助质粒pHelper1.0、pHelper2.0混合后通过脂质体转染293T细胞，收集培养48h的细胞上清液，经离心，上清液过滤后得到慢病毒载体LV‑IFNAR2‑RNAi；(3)通过上述慢病毒载体，将IFNAR2基因siRNA导入DF‑1细胞系，沉默IFNAR2基因的表达，提高H5N2型禽流感病毒在DF‑1细胞系中的增殖滴度。