[发明专利]一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法

摘要

本发明公开了一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，包括以下步骤：(1)基因组DNA的提取；(2)基因克隆及工程菌的制备；(3)细胞液制备：(4)全细胞催化反应：在步骤3)的细胞液中，加入苯丙酮酸和氨基供体作为底物，加入辅助底物用于辅酶循环再生，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物手性苯丙氨酸。本发明的方法采用全细胞催化苯丙酮酸不对称还原胺化获得手性苯丙氨酸，具有反应路线简洁，易实现辅酶再生等优点。

主权项

一种酶催化不对称还原制备手性苯丙氨酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将菌种接入2216L培养基中培养后，提取基因组DNA；所述菌种为嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)MCCC 1B00241；(2)以步骤(1)所得基因组DNA为模板扩增如SEQ ID 01所示的苯丙氨酸脱氢酶基因序列，并装载到pET28a载体上，转入大肠杆菌中即得到工程菌；(3)将步骤(2)所得工程菌接入含卡那霉素的LB液体培养基中培养，培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心获得细胞，用缓冲液重悬、洗涤，配置成细胞液；(4)在步骤(3)所得细胞液中，加入苯丙酮酸和氨基供体作为底物，加入辅助底物用于辅酶循环再生，利用全细胞催化不对称还原胺化反应得到产物手性苯丙氨酸，上述反应条件为：pH 7～13，反应温度20℃～50℃下，震荡速率100～300rpm，反应时间24～168h；体系中NADH的量为浓度1～1.5mM的溶液0.05～0.07mL，所述苯丙酮酸在反应体系中的的终浓度为0.02～0.5mol/L，所述氨基供体为终浓度0.05～1mol/L的氨水、NH4Cl、NH4NO3或甲酸铵，所述辅助底物为终浓度0.001～1mol/L的葡萄糖、甘油、木糖、半乳糖何异丙醇中的至少一种，所述缓冲液为0.01～0.2mol/L的pH为7～13的NH4Cl‑氨水，Tris～盐酸、乙酸钠溶液、碳酸钠溶液或磷酸钾溶液。