[发明专利]一种检测食树脂新鞘氨醇菌的引物及定量检测方法

摘要

本发明涉及一种检测食树脂新鞘氨醇菌(Novosphingobium resinovorum)的引物及定量检测方法。所述检测食树脂新鞘氨醇菌的引物为一对，分别为正向引物SEQ ID NO.1和反向引物SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。本发明还公开了利用该引物定量检测食树脂新鞘氨醇菌的方法。本发明的实时荧光定量PCR技术可以快速定量检测环境中的食树脂新鞘氨醇菌，为研究生物修复芳烃污染提供了一种快速、准确的研究方法。

主权项

一种食树脂新鞘氨醇菌(Novosphingobium resinovorum) 的定量检测方法，其特征在于，步骤如下：（1）提取食树脂新鞘氨醇菌(Novosphingobium resinovorum) 的基因组DNA，得基因组DNA溶液；（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，利用引物进行PCR扩增，经纯化后，与载体连接后转化感受态细胞DH5α，涂含氨苄抗生素的LB平板培养，挑取阳性克隆进行扩大培养，提取质粒，经验证后，制得标准检测溶液原液，经紫外分光光度计测定浓度并换算拷贝数，换算公式：DNA拷贝数=（6.02×1023）×（DNA浓度×10‑9）/（DNA长度×660）所述DNA拷贝数单位为：copies/μl，DNA浓度单位为：ng/μL；（3）将步骤（2）制得的标准检测溶液原液按照10倍梯度稀释，获得不同浓度的稀释液，以获得的稀释液为扩增模板，通过定量PCR扩增，得到扩增标准曲线如下：y=‑3.459log（x）+43.197；其中，y 为Ct值，x为质粒DNA拷贝数浓度；（4）取待检测样品，提取待测样品基因组DNA，制得待检测扩增模板，按照步骤（3）中定量PCR扩增的条件，检测样品的Ct值，Ct值为循环阈值，对照标准曲线，得出待检测样品中食树脂新鞘氨醇菌的DNA浓度；所述步骤（3）和步骤（4）中定量PCR扩增体系如下，共25μL：含SYBR GreenI 的2×SuperReal PreMix 10μL，浓度10mM正向引物0.5μL，浓度10mM反向引物0.5μL，DNA模板2μL，ddH2O 12μL；PCR扩增程序如下：95℃预变性15min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸40s，共40个循环；上述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。