[发明专利]小鼠脑组织蛋白质组分析的样品制备方法

摘要

本发明涉及一种小鼠脑组织蛋白质组分析的样品制备方法，该方法包括以下步骤⑴心尖灌流替换血液取小鼠一只麻醉后进行缓慢心尖灌流，待肝脏呈灰白色时停止并取出脑组织；⑵蛋白提取将脑组织研磨成粉末状后加入预冷的Tris缓冲液，经超声处理、摇床孵育、离心得蛋白提取液Ⅰ；⑶热处理增加蛋白溶解性将蛋白提取液Ⅰ与热处理液混合后处理5min，经离心得蛋白提取液Ⅱ；⑷沉淀去脂将蛋白提取液Ⅱ加入到预冷的去脂沉淀液CUS中，经沉淀、离心、洗涤、吹干，即得纯化蛋白粉末；⑸蛋白重溶将纯化蛋白粉末加入到尿素蛋白裂解液中，经离心得蛋白质组样品。本发明可经济、高效去除小鼠脑组织血液、脂类影响，并增加蛋白样品溶解性。

主权项

小鼠脑组织蛋白质组分析的样品制备方法，包括以下步骤：⑴蛋白提取：将小鼠脑组织放入盛有液氮的研钵中进行研磨，直至脑组织被研磨成粉末状；然后称取0.2~0.5g脑组织粉末转至1.5mlEP离心管中，按照300µl：0.1g的比例向所述EP离心管中加入4℃预冷的pH=8.1、50mM的Tris缓冲液；其次将所述EP离心管放在冰盒中进行超声处理，之后置于摇床上孵育1~2h，期间涡旋3~5次，最后经离心得上清液A，该上清液A即为蛋白提取液Ⅰ；⑵热处理增加蛋白溶解性：将所述蛋白提取液Ⅰ按照1：1的体积比与SDS浓度为10%的热处理液混合后，在100℃处理5min，最后经离心得上清液B，该上清液B即为蛋白提取液Ⅱ；⑶沉淀去脂：将所述蛋白提取液Ⅱ加入到其14倍体积的4℃预冷的去脂沉淀液CUS中，4℃沉淀90min，期间涡旋3~5次；然后离心得沉淀物，该沉淀物用4℃预冷的丙酮洗两次；室温下经15min~30min吹干去除丙酮，即得纯化蛋白粉末；所述去脂沉淀液CUS是由磷酸三丁酯：丙酮：甲醇按照体积比为1：12：1配制而成；⑷蛋白重溶：将所述纯化蛋白粉末按照1：3的质量体积比加入到尿素蛋白裂解液中，置35℃温箱摇晃1h，经离心得上清液C，该上清液C经蛋白定量后即为蛋白质组样品；所述步骤⑷中尿素蛋白裂解液是指10ml溶液中含有4.2g的尿素、1.52g的硫脲、0.4g的3‑[3‑(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐；并按照0.098g/ml现加二硫苏糖醇，按照5µl/ml分别现加Bio‑Lyte pH4‑6和Bio‑Lyte pH6‑8，按照40µl/ml现加蛋白酶抑制剂。