[发明专利]一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法

摘要

本发明公开一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法，即首先用Tris‑HCl缓冲液将辅酶I配置成不同浓度梯度的辅酶I溶液，检测不同浓度的辅酶I溶液的荧光值，制作辅酶I浓度与荧光值相对应的标准曲线，将由粗乙醛脱氢酶酶液、pH7.0‑9.0，0.1 mol/L Tris‑HCl缓冲液等形成的反应体系控制温度为25‑40℃保持10‑30min后，在激发波长为320nm‑380nm，发射波长为440nm‑480nm下测定反应体系中粗乙醛脱氢酶酶液酶液每分钟的荧光变化值，最后依公式酶活力单位=△荧光值/3来计算乙的醛脱氢酶酶活力单位。该测定方法操作简便，灵敏度高。

主权项

一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法，其特征在于具体包括以下步骤：（1）、配制0.01‑0.2mol/L的Tris‑HCl缓冲液，pH7.0‑9.5；（2）、激发波长为320nm‑380nm，发射波长为440nm‑480nm；（3）、用pH7.0‑9.5、浓度为0.01‑0.2mol/L的Tris‑HCl缓冲液配制浓度为5×10‑4‑0.39×10‑5 mol/L的辅酶Ⅰ溶液，并测定辅酶Ⅰ溶液荧光值，然后以辅酶Ⅰ溶液荧光值为横坐标、以辅酶Ⅰ浓度为纵坐标，获得辅酶Ⅰ溶液荧光值和辅酶Ⅰ浓度之间的标准曲线；（4）、取细胞培养液经4℃、5000r/min离心15min，收集所得的细胞中加入为细胞体积3倍的磷酸缓冲液，然后在超声功率150W，超声6s间隔8s，超声总时间28min进行细胞破碎，然后控制温度0‑6℃、转速8000‑14000r/min离心10‑30min，收集上清液作为粗乙醛脱氢酶酶液；所述的磷酸缓冲液按每升计算，含0.24g KH2PO4，1.44g Na2HPO4, 8.0g NaCl，0.2g KCl和余量的水；或取血液作为粗乙醛脱氢酶酶液；或组织匀浆液控制温度0‑6℃、转速8000‑14000r/min离心10‑30min，收集的上清液作为粗乙醛脱氢酶酶液；（5）、将步骤（4）所得的粗乙醛脱氢酶酶液、pH7.0‑9.0，0.1 mol/L Tris‑HCl缓冲液、1×10‑3‑5×10‑3mol/L乙醛水溶液、0.1‑0.5 mol/LKCl水溶液、5×10‑4‑1×10‑3 mol/L NAD+水溶液和0.01‑0.05mol/L硫基乙醇水溶液混合，形成的反应体系控制温度为25‑40℃保持10‑30min后，在激发波长为320nm‑380nm，发射波长为440nm‑480nm下，测定反应体系中粗乙醛脱氢酶每分钟的荧光变化值；所述的反应体系，按每3ml计算，其组成及含量如下：pH7.0‑9.0，0.1 mol/L Tris‑HCl缓冲液       2.57.ml1×10‑3‑5×10‑3mol/L乙醛水溶液            0.1ml0.1‑0.5 mol/LKCl水溶液                   0.1ml5×10‑4‑1×10‑3 mol/L NAD+水溶液           0.1ml0.01‑0.05mol/L硫基乙醇水溶液             0.03ml粗乙醛脱氢酶酶液                         0.1ml；（6）、步骤（3）所得辅酶Ⅰ溶液荧光值x和 辅酶Ⅰ浓度y之间标准曲线的线性方程为：y=0.0686x‑3.6621，y的单位为1×10‑4mol/L定义每生成0.0686×10‑4mol/L辅酶Ⅰ为一个酶活力单位U；根据下述的公式计算乙醛脱氢酶酶活力；酶活力单位（U/mL）=△荧光值/3；其中△荧光值为步骤（5）中的反应体系中粗乙醛脱氢酶每分钟的荧光变化值；3mL是反应体系总体积。