[发明专利]基于流式细胞术测定浅水湖泊中异养细菌大小的方法

摘要

本发明的目的是建立一种快速测定浅水湖泊总异养细菌大小的方法，是一种基于流式细胞术的测定细菌大小的方法。首先将样品固定、超声、过滤、SYBRGreenⅠ染色，然后通过流式细胞仪来检测异养细菌，根据流式细胞仪的前向散射光（FSC，反映细胞大小）来测定样品中异养细菌的FSC值，再通过建立标准微球粒径与FSC值的关系，绘制细菌大小的标准曲线，建立回归分析方程，最后通过样品中异养细菌的前向散射光（FSC）值，换算成样品中异养细菌的大小。

主权项

一种基于流式细胞术测定浅水湖泊中异养细菌大小的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）样品固定：在待测样品中加入终体积浓度为0.5‑1.5%，优选1%的固定剂，避光2‑4小时；（2）样品前处理：吸取至少500µl样品，用无菌水1:8‑1:12，优选1:10稀释后进行超声波处理；（3）样品染色：吸取1ml样品，在样品中加入特异性核酸染料SYBR Green Ⅰ，避光静置；（4）样品的流式细胞分析：将样品管放置于流式细胞仪的样品台上，通过流式细胞仪对样品进行测试，采集前向散射光FSC、侧向散射光SSC、FL1通道的核酸染料SYBR GreenⅠ绿色荧光信号、FL3通道的自养浮游生物的叶绿素a红色荧光信号数据；其中以核酸染料SYBR GreenⅠ绿色荧光信号设置域值，利用绿色荧光信号将浅水湖泊中的浮游生物与非生物颗粒、细胞碎屑区分开来，同时根据FL3通道采集的自养浮游生物的叶绿素a的红色荧光信号，将细菌与浮游藻类区分开来，最后通过流式细胞仪测试异养细菌的FSC值代表细菌大小；（5）细菌大小标准曲线的绘制：选取不同粒径规格标准绿色微球，利用流式细胞仪分别进行测试，采集前向散射光FSC、侧向散射光SSC、FL1通道的绿色荧光信号，通过多次测定它们的FSC值，建立细胞粒径与FSC 的关系；（6）数据分析：通过流式细胞仪分析软件分析采集到的数据，利用前向散射光与侧向散射光的不同，排除微型浮游生物对细菌检测的影响；依据核酸染料SYBR GreenⅠ绿色荧光信号的强弱，将浮游生物与非生物颗粒、细胞碎屑区分开来；根据自养浮游生物的叶绿素a红色荧光信号的强弱，将细菌与浮游藻类区分开来，从而获得目标对象样品中的异养细菌，通过流式细胞仪得到异养细菌前向散射光FSC值，再根据细菌大小的标准曲线计算出样品中异养细菌的大小。