[发明专利]一种增强脂肪间充质干细胞免疫学性能和迁移能力的方法

摘要

本发明涉及细胞治疗技术领域脂肪间充质干细胞技术领域，特别涉及一种增强脂肪间充质干细胞免疫调节功能和迁移能力的方法，将分离得到的脂肪间充质干细胞进行原代培养、传代培养后，用含有低浓度TLR3激活剂Poly(I:C)的培养基进行短时间培养。经过Poly(I:C)共刺激培养后，所得到的具有全新表型的脂肪间充质干细胞具备更强的迁移能力，并且分泌细胞因子和趋化因子的水平发生改变，总体表现出更强的免疫抑制功能。

主权项

一种增强脂肪间充质干细胞免疫学性能和迁移能力的方法，其特征在于，步骤如下：将分离提取的脂肪间充质干细胞原代培养至80％融合，再进行传代培养，选用生长良好的第三代细胞，用含有TLR3激活剂Poly(I:C)的细胞培养液进行共培养，最后进行实验组和对照组的Real‑time PCR和趋化性实验对比检测；(1)脂肪间充质干细胞的分离及原代培养从小鼠腹股沟部剪取脂肪组织，用HBSS缓冲液冲洗，充分剪碎，加入0.1％I型胶原酶进行消化，然后过滤并离心10min得到的细胞生长培养液；对细胞生长培养液进行重悬沉淀得到细胞悬液，将细胞悬液接种到培养瓶中，置于5％CO₂细胞培养箱中进行原代培养；(2)脂肪间充质干细胞的传代培养待步骤(1)原代培养至80％融合，用含0.25g/100mL EDTA的胰蛋白酶液进行消化，重悬细胞，然后接种到培养皿中传代培养；待细胞培养至80％融合后，进行传下一代培养，得到第三代脂肪间充质干细胞；(3)POLY(I:C)对脂肪间充质干细胞的刺激用含有TLR3激活剂Poly(I:C)的细胞生长培养液培养步骤(2)培养1h，得到的第三代脂肪间充质干细胞，然后用含0.25g/100mL EDTA的胰蛋白酶液进行消化，重悬细胞；所述的含有TLR3激活剂Poly(I:C)的细胞生长培养液中Poly(I:C)的含量为1μg/mL；细胞生长培养液中含有L‑谷氨酸钠2mM、三抗的体积百分数1％、胎牛血清的体积百分数10％；含有TLR3激活剂Poly(I:C)的细胞生长培养液为DMEM/F121:1培养基；(4)Real‑time PCR检测细胞因子和趋化因子的表达利用Real‑time PCR方法分别对经过Poly(I:C)共培养后的脂肪间充质干细胞和未经Poly(I:C)刺激的脂肪间充质干细胞进行对比实验，对二者IL‑6、TGF‑β、MCP‑1、KC、Eotaxin‑1、VEGF细胞因子或趋化因子mRAN表达水平进行检测；(5)体外趋化性试验利用transwell小室进行细胞侵袭试验，分别取生长至80％融合的经过Poly(I:C)共培养后的脂肪间充质干细胞和未经Poly(I:C)刺激的脂肪间充质干细胞，接种于小室滤膜上方；下室中加入占小孔体积25％的细胞生长培养液，过夜孵育，然后取下小室，用PBS缓冲液小心淋洗滤膜下层，棉签擦去滤膜上层细胞及杂质；钙黄绿素染色，进行荧光分析。