[发明专利]一种水稻工程保持系的构建方法及其应用

摘要

本发明公开了一种水稻工程保持系的构建方法，包括步骤一、将外源报告基因定点整合到野生型水稻的染色体上得到含有外源报告基因的转基因株系，其中，该外源报告基因与野生型育性调控基因能够紧密连锁遗传；以及，之后进入步骤二，步骤二、将步骤一中得到的转基因株系与纯合隐性水稻普通雄性核不育株系杂交，筛选含有外源报告基因的株系即为所需要的水稻工程保持系，其中，该纯合隐性水稻普通雄性核不育株系为育性调控基因突变体株系。本发明还公开了水稻工程保持系在水稻育种中的应用。本发明将外源报告基因定点整合到野生型水稻的染色体上，解决了转化受体材料受限制的问题。本发明的水稻工程保持系可用于水稻普通隐性雄性核不育系繁殖中。

主权项

一种水稻工程保持系的构建方法，其特征在于，包括：步骤一、将外源报告基因定点整合到野生型水稻的染色体上得到含有外源报告基因的转基因株系，其中，该外源报告基因与野生型育性调控基因能够紧密连锁遗传；以及，之后进入步骤二，步骤二、将步骤一中得到的转基因株系与纯合隐性水稻普通雄性核不育株系杂交，筛选含有所述外源报告基因的株系即为所需要的水稻工程保持系，其中，该纯合隐性水稻普通雄性核不育株系为所述育性调控基因突变体株系；所述步骤一中，获得含有外源报告基因的转基因株系的具体方法包括：(1.1)分析野生型水稻染色体上育性调控基因的上下游序列区域，取该区域内NGG前面的20bp作为靶位点区域，并设计与该靶位点区域配对的引物序列，在引物上游序列前加GCAA，在引物下游序列前加AAAC，得到引物:上游序列：5’–GCAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3’下游序列：5’–AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3’，其中“N”指代碱基A、T、C或G；(1.2)根据CRISPR/Cas9系统，将步骤(1.1)中的引物序列构建到pP1C.1载体上得到基因整合载体；(1.3)将外源报告基因构建到植物表达载体上得到重组表达载体；(1.4)将所述重组表达载体和所述基因整合载体共转化野生型水稻，得到转基因植株；(1.5)在靶位点两翼设计引物，以转基因植株基因组进行扩增，若扩增产物片段大小与外源报告基因片段大小大致相等，则判定该植株为含有外源报告基因的水稻转基因株系，并且在靶位点定点插入整合。