[发明专利]快速定量检测ST2和NT-proBNP的免疫荧光试纸条及其制备方法在审

专利信息
申请号: 201510261064.1 申请日: 2015-05-20
公开(公告)号: CN104865387A 公开(公告)日: 2015-08-26
发明(设计)人: 刘红剑;威廉姆·努特;刘丽萍;张丹;黄凯 申请(专利权)人: 瑞莱生物科技(江苏)有限公司
主分类号: G01N33/68 分类号: G01N33/68
代理公司: 南京正联知识产权代理有限公司 32243 代理人: 卢霞
地址: 225300 江苏省泰州市中*** 国省代码: 江苏;32
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摘要: 发明公开了一种快速定量检测ST2和NT-proBNP的免疫荧光试纸条及其制备方法,它包括支撑片以及支撑片上顺次搭接粘贴的样品垫片、检测膜和吸水垫片,所述样品垫片和检测膜之间设有偶合物垫片,所述检测膜上设有检测线,所述检测线包被有抗ST2和/或抗NT-proBNP单克隆抗体或多克隆抗体,所述ST2抗体和/或NT-proBNP抗体设在同一位置或设在相邻位置,所述检测线另一边设有控制线,控制线包被有抗链霉亲和素(SAV)抗体,所述偶合物垫片上涂布有含有不同荧光标记的ST2抗体和NT-proBNP抗体偶合物。该试纸具有方便快捷、操作简单、结果准确等优点,适于临床快速诊断。
搜索关键词: 快速 定量 检测 st2 nt probnp 免疫 荧光 试纸 及其 制备 方法
【主权项】:
一种快速定量检测可溶性生长刺激表达基因2蛋白(ST2)和N‑末端脑钠肽(NT‑proBNP)的免疫荧光试纸条,包括试纸条支撑片(4)以及试纸条支撑片(4)上顺次搭接粘贴的样品垫片(1)、检测膜(2)和吸水垫片(3),所述样品垫片(1)和检测膜(2)之间设有偶合物垫片(5),所述的偶合物垫片(5)一端上方设有第一层玻璃纤维垫片(6‑1),其一端下方设有第二层玻璃纤维垫片(6‑2)或者偶合物垫片(5)一端上方仅设有第一层玻璃纤维垫片(6‑1)或者不设有任一垫片,其特征在于:所述检测膜(2)上设有检测线1(7‑1)、检测线2(7‑2),所述检测线1(7‑1)包被有抗ST2单克隆抗体或多克隆抗体,所述检测线2(7‑2)包被有抗NT‑proBNP单克隆抗体或多克隆抗体,所述的检测线1(7‑1)、检测线2(7‑2)设在检测膜(2)的同一位置或设在相邻位置,若为不同位置,则检测线1(7‑1)、检测线2(7‑2)均位于控制线(8)同一侧,控制线(8)包被有抗链霉亲和素(SAV)抗体,所述偶合物垫片(5)上涂布有含有不同荧光标记的ST2抗体和NT‑proBNP抗体偶合物,所述偶尔物垫片(5)中的含有不同荧光标记的ST2抗体偶合物和NT‑proBNP抗体偶合物通过如下步骤制成:1)Dye‑649 NHS Ester‑ST2抗体偶合物以及Biotin‑NT‑proBNP抗体的制备1.1)Dye‑649 NHS Ester‑ST2抗体偶合物的制备:ST2抗体溶于碳酸盐缓冲液(0.5M Boarte buffer, pH=8.5)中,活化的Dye‑649 NHS Ester溶解于二甲基亚砜(DMSO)中溶解,然后把ST2抗体加入碳酸盐缓冲液(0.5M Boarte buffer, pH=8.5)中混匀后,加入准备好的Dye‑649 NHS Ester溶液,37度反应1小时,反应完成后,将偶合物溶液转移至超滤管中进行纯化,并多次用1XPBS磷酸盐缓冲液冲洗,直至超滤管的底部无游离的荧光分子,并计算纯化后的Dye‑649 NHS Ester‑ST2抗体偶合物的标记个数;1.2)Biotin‑NT‑proBNP抗体的制备:NT‑proBNP抗体溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中,活化的生物素(Biotin)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中保证其活化度,然后把生物素(Biotin)加入溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中的NT‑proBNP抗体溶液中,25度反应30分钟,反应完成后,将溶液转移至超滤管中,以4000rpm并多次纯化,直至超滤管底部无游离的生物素(Biotin),并计算每个NT‑proBNP抗体可能结合的生物素(Biotin)个数;2)DyLight‑800 NHS Ester‑SAV的制备:抗链霉亲和素(SAV)粉末溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中活化,然后把溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中的抗链霉亲和素(SAV)快速溶解荧光素粉末,并加入碳酸盐缓冲液(0.05M Borate buffer)进行缓冲,室温反应1小时,反应完成后,将溶液超滤离心浓缩,并多次纯化,直至无游离的荧光素出现在超滤管的底部,纯化好的DyLight‑800 NHS Ester‑SAV,在分光光度计下检测OD278nm和OD788nm的光密度值,然后计算每个荧光分子可能结合的抗链霉亲和素(SAV)的标记个数;3)DyLight‑800 NHS Ester‑SAV‑Biotin‑NT‑proBNP抗体偶合物的制备:DyLight‑800 NHS Ester‑SAV‑Biotin‑NT‑proBNP偶合物的制备方法:按照SAV:Biotin的比例1:4计算需要加入DyLight‑800 NHS Ester‑SAV和Biotin‑NT‑proBNP抗体的浓度,然后用磷酸盐缓冲液(PBS)补充反应体积,按照计算所需的量依次加入1XPBS , Biotin‑NT‑proBNP和DyLight‑800 NHS Ester‑SAV,充分混合后,在OD500nm下检测荧光偶合物的透过率(T%),并在透过率达到要求时进行终止反应,形成DyLight‑800 NHS Ester‑SAV‑Biotin‑NT‑proBNP。
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