[发明专利]一种海鞘多肽CS5931的制备方法

摘要

一种海鞘多肽CS5931的制备方法，属于药学科学领域，包括重组CS5931大肠杆菌表达体系发酵、海鞘多肽CS5931的分离纯化和变性复性。在发酵过程中IPTG添加的终浓度为0.4mM‑0.7mM；所述的活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中培养的接种量在3‑6％；所述的工程菌活化后接种入LB培养基中的装液量在20‑45％；所述IPTG加入后的发酵培养温度为23℃‑30℃。优化后表达收率达到0.703g/L，与现有技术相比提高了2.01倍。纯化后的多肽对人结肠癌细胞HCT116的抑制作用增强，IC50值由现有技术的1.94μM降低到了1.41μM。

主权项

一种海鞘多肽CS5931的制备方法，包括重组海鞘多肽CS5931大肠杆菌表达体系发酵、海鞘多肽CS5931的分离纯化和变性复性，其特征在于：所述的重组海鞘多肽CS5931大肠杆菌表达体系发酵：克隆编码海鞘多肽CS5931的基因连接入含有分子伴侣pG‑KJE8的质粒PET‑21a载体上，导入表达菌BL21构成工程菌BL21/pET21a‑CS5931，将BL21/pET21a‑CS5931接种在含有氨苄的LB培养基中进行活化，活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中培养，接种后4‑5h时加入L‑阿拉伯糖、四环素及IPTG进行诱导，继续发酵培养4.5‑8.5h；IPTG添加的终浓度为0.4mM‑0.7mM；所述的活化后的种子液转接入含有氨苄的LB培养基中的接种量体积比在3‑6％；所述的pET21a‑CS5931活化后接种入LB培养基中发酵的装液量体积比在20‑45％；所述加入IPTG后的发酵温度为23℃‑30℃；所述的海鞘多肽CS5931的分离纯化：通过镍离子金属螯合层析方法纯化重组海鞘多肽CS5931的可溶性表达组分；利用组氨酸侧链上的咪唑基与金属离子Ni2+螯合的特性，使带有His标签的重组海鞘多肽CS5931得到分离，并利用60‑75mM咪唑缓冲液洗涤杂蛋白，250‑350mM咪唑缓冲液洗脱目的多肽CS5931，使目的蛋白得到纯化；所述的变性复性：向洗脱得到的目的蛋白溶液中分次缓慢加入8M尿素，1‑3mM L‑半胱氨酸，0.3‑0.6mM L‑精氨酸，0.3‑0.6mM EDTA，反应3‑5h；多肽样品变性完成后，将变性样品放于透析袋中，在复性液中透析24‑30h，期间换1次复性液；复性完成后，将复性液更换为透析液，透析3‑5h，将透析完成的样品加入1‑2倍于样品多肽的甘露醇后冻干得到纯化后的海鞘多肽CS5931。