[发明专利]一种用于检测农药残留的重组家蚕乙酰胆碱酯酶的制备方法

摘要

本发明公开了一种用于检测农药残留的重组家蚕乙酰胆碱酯酶的制备方法。本发明将家蚕乙酰胆碱酯酶基因与锚定蛋白基因AGα1相连插入到酵母表达载体pPIC9K中构建成表面展示载体并转化毕赤酵母GS115，筛选阳性重组子，并利用甲醇对阳性重组子进行诱导表达，表达结束后离心去除上清液，将菌体冷冻干燥即得重组家蚕乙酰胆碱酯酶。制备得到的重组酶稳定性好、操作简单、检出限低、灵敏度高、尤其成本低廉，可在家庭、市场、蔬菜生产基地等进行现场检测，非常适合大量样品的筛查，具有重要的实际应用推广意义。

主权项

一种用于检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的重组家蚕乙酰胆碱酯酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1）采用Trizol试剂抽提家蚕头部总RNA；用RT‑PCR试剂盒以家蚕头部总RNA为模板，Oligo(dT)18为引物，在M‑MuLV反转录酶的作用下反转录合成cDNA第一链；以第一链cDNA为模板通过PCR扩增家蚕乙酰胆碱酯酶基因bmace，将bmace基因连入PMD‑18‑T载体，连接产物转化转化大肠杆菌DH5α；以重组质粒PMD‑18‑T‑bmace为模板PCR扩增带MluⅠ酶切位点的bmace基因，并在5′端引入6×His标签；2）使用酵母基因组抽提试剂盒提取酿酒酵母INVSc1基因组DNA，以此为模板通过PCR扩增锚定蛋白基因AGα1，同时在扩增片段的5′端引入一段linker序列；3）通过PCR将步骤1）中的bmace基因与步骤2）中的锚定蛋白基因AGα1预拼接在一起，通过重叠延伸PCR扩增融合基因bmace‑AGα1；4）将酵母表达载体pPIC9K和步骤中的融合基因bmace‑AGα1同时做双酶切，酶切过后将二者连接在一起构成重组质粒pPIC9K‑bmace‑AGα1，连接产物转化大肠杆菌DH5α；经过PCR鉴定和酶切鉴定正确后将重组载体pPIC9K‑bmace‑AGα1转化毕赤酵母GS115形成转化子GS115/pPIC9K‑bmace‑AGα1，筛选阳性重组子，并利用甲醇对阳性重组子进行诱导表达，表达结束后离心去除上清液，将菌体冷冻干燥即得重组家蚕乙酰胆碱酯酶；所述PCR扩增的引物如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.14所示。