[发明专利]一种用于藻细胞的单细胞凝胶电泳的方法

摘要

本发明公开了一种用于藻细胞的单细胞凝胶电泳的方法。包括单细胞凝胶电泳试剂的配制、微电泳槽的制作、绿藻细胞的样品制备方法和单细胞凝胶电泳步骤改进与优化。微电泳槽的制作采用普通的光滑载玻片，并通过载玻片表面改性，使所铺制的凝胶只有一层，与传统样品制备载玻片上要铺制三层凝胶以及随后的改进型两层凝胶工艺相比，具有样品制备工艺简单、成功率高、易于操作、背景荧光值低、样品图像清晰和实验成本低等优点。基于绿藻细胞具有细胞壁的特点，改进了细胞裂解步骤的条件；根据不同类型的DNA损伤形式，加入相应的核酸内切酶进行酶解的步骤，使得绿藻细胞内的损伤的核DNA更易在电场作用下发生迁移，使实验成功率发生显著提高。

主权项

一种用于藻细胞的单细胞凝胶电泳的方法，包括以下步骤：1)微电泳槽的制作和表面改性：用玻璃刀沿光滑载玻片的宽将载玻片划成20～25个25mm×3mm×1mm的窄条；然后将这些窄条用中性玻璃胶贴到干净的光滑载玻片上，围成正方形小槽，即为微电泳槽；微电泳槽的表面改性采用镀膜法，即微电泳槽在2g/L的正常熔点琼脂糖浸没1min后，置37℃孵箱烘烤2～12h；2)原生质体的制备：将藻培养液离心，去上清液，藻细胞悬浮于酶解液中，使藻细胞密度为107个/mL，25℃避光保温1.5h；1000×g离心1min，然后用同体积0.55mol/L甘露醇洗涤一次，再次离心后轻柔悬浮于0.55mol/L甘露醇中；所述的酶解液为0.55mol/L甘露醇加入20g/L纤维素酶和10g/L离析酶，pH 5.8；3)包埋细胞：将悬浮于甘露醇中的细胞与熔化的浓度是7.5～10g/L低熔点琼脂糖混匀，使100μL低熔点琼脂糖凝胶中含有4000～5000个细胞，平铺于微电泳槽中；4)细胞裂解：将包埋好藻细胞的微电泳槽放在表面皿中，加入藻细胞裂解液，液面没过微电泳槽，4℃避光裂解1～2h；所述的细胞裂解液为2.5mol/L NaCl，100mmol/L EDTA，10mmol/L Tris，pH 10，1％Triton X‑100，10％DMSO；5)酶解：利用特异性识别DNA损伤并将受损的DNA切割成DNA断片的核酸内切酶按1:103～1:104倍数进行稀释，37℃酶解30～45min；6)碱解旋：将包埋有藻细胞的微电泳槽置于碱性电泳液中4℃解旋20～40min；7)电泳，中和，干燥和染色，拍照与结果分析。