[发明专利]一种苦参碱抑制人胰腺癌细胞迁移的分析方法

摘要

本发明公开了一种苦参碱抑制人胰腺癌细胞迁移的分析方法，包括以下步骤：人胰腺癌细胞培养、单层细胞迁移分析、细胞浸润分析、酶联免疫吸附分析和免疫印迹分析。采用本方法分析后能得知苦参碱作用一定时间能显著降低人胰腺癌细胞的迁移与浸润能力，人胰腺癌细胞迁移相关蛋白MT1-MMP及Wnt、β-Catenin表达明显降低；进一步检测发现MT1-MMP转录活性也显著降低，与Wnt信号通路活性一致，苦参碱通过调节Wnt通路活性，降低MT1-MMP的转录与表达，进而抑制人胰腺癌细胞的迁移与浸润。

主权项

一种苦参碱抑制人胰腺癌细胞迁移的分析方法，其特征在于：依次包括以下步骤：a）人胰腺癌细胞培养：将人胰腺癌细胞培养于RPMI‑1640培养基中，RPMI‑1640培养基中含胎牛血清、生物活性为100 IU/mL的青霉素和生物活性为100 µg/mL的链霉素，RPMI‑1640培养基培养于37°C， CO₂体积浓度为5%培养箱中；b）单层细胞迁移分析：将人胰腺癌细胞接种于6孔板中培养24h，当人胰腺癌细胞汇合度达90%以上时，用200μl无菌Tip枪头固定一个角度进行划痕，然后使用无菌PBS洗去人胰腺癌细胞碎片，再加入新鲜的RPMI‑1640培养基，其中一组不加入苦参碱作为空白组，药物处理组分别加入浓度为25μg/ml、50μg/ml苦参碱作用24‑48h，最后通过倒置相差显微镜跟踪拍摄细胞迁移能力；c）细胞浸润分析：将处于对数生长期的人胰腺癌细胞按4×10⁴密度接种于细胞浸润小室，细胞浸润小室上部为含有2% FBS的的RPMI‑1640完全培养基，细胞浸润小室下部为含有10% FBS的RPMI‑1640完全培养基，人胰腺癌细胞在培养箱中孵育2h后，分别加入浓度为0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml的苦参碱处理并在培养箱中孵育10h，然后加入多聚甲醛室温固定15min，使用无菌PBS洗三次后加入0.2%结晶紫染10min，去离子水冲洗干净后置于倒置显微镜下拍照计数，实验重复三次进行统计分析；d）酶联免疫吸附分析：将处于对数生长期的人胰腺癌细胞按4×10⁴密度接种于6孔板培养过夜后，分别加入浓度为0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml的苦参碱处理并在培养箱中孵育24h，将人胰腺癌细胞进行裂解处理，收集人胰腺癌细胞上清液，分别采用MMP‑9 ELISA试剂盒、MMP‑2 ELISA试剂盒来检测不同实验组中MMP‑9和MMP‑2的浓度；e）免疫印迹分析：收集人胰腺癌细胞加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂Cocktail，在冰浴中裂解30min，离心机离心30min后收集上清，通过BCA法测蛋白浓度并均衡各组蛋白，同等量细胞总蛋白用于12% SDS‑PAGE电泳，蛋白经湿转法转到PVDF膜，室温下添加5%脱脂奶粉后封闭1h，然后加入兔抗人wnt、β‑catenin、MT1‑MMP，在4℃的温度下孵育过夜，采用PBST缓冲液洗三次，加入HRP标记的山羊抗兔二抗，室温孵育1h，PBST缓冲液洗三次后，加入ECL超敏发光液，将PVDF膜进行压片、曝光、显影及定影，图像经Image J软件灰度扫描后进行统计分析。