[发明专利]交联固定脂肪酶的超顺磁载体的制备方法

摘要

本发明公开一种交联固定脂肪酶的超顺磁载体的制备方法，通过纳米磁性微球Fe3O4的制备、纳米磁性微球Fe3O4的包裹、纳米微球的功能化修饰等操作实现。通过本发明方法制备的超顺磁载体，引入温敏材料聚N‑异丙基丙烯酰胺，能够通过控制温度改变载体的结构特性，从而使得通过该载体固定后的脂肪酶能够摆脱界面特性的控制，直接在醇、酸和酯类之间反应，有利于反应产物的分离；有利于通过α盖控制酶活性。该超顺磁载体是基于脂肪酶界面活性作用方式的超顺磁聚合微球，通过该微球对脂肪酶进行固定，固定化的脂肪酶具备良好的磁分离性能，保留90%以上的酶活性，克服酶促反应中脂肪酶活依赖界面效应的劣势。

主权项

一种交联固定脂肪酶的超顺磁载体的制备方法，其特征在于经过下列各步骤：（1）纳米磁性微球Fe3O4的制备：将FeCl3·6H2O溶解于无水乙二醇中，配置成浓度为0.1～0.15mmol/mL的溶液，再按FeCl3·6H2O与处理剂的质量比为1 : 4～6加入处理剂，其中处理剂为乙酸钠和聚乙二醇，加入处理剂后使乙酸钠的浓度为80～120mg/mL，然后在200℃下恒温超声反应4～6h，待自然冷却后，用乙醇和去离子水洗涤数次，再经真空干燥即得纳米磁性微球Fe3O4；（2）纳米磁性微球Fe3O4的包裹：将步骤（1）所得纳米磁性微球Fe3O4与浓度为1mol/L的NaOH溶液混合，直至得到纳米磁性微球Fe3O4的浓度为4～8mg/mL的悬浮液，将悬浮液经超声波分散均匀，然后加入3倍悬浮液体积的无水乙醇、加入纳米磁性微球Fe3O4质量1/5～1/10的包埋剂以及加入悬浮液体积1/2的氨水，再在100℃下搅拌反应40min得到磁流体，然后将磁流体在1～2T的磁场条件下静置完成磁分离，再对磁流体进行固液分离，所得固体用乙醇和去离子水洗涤数次，即得包裹后的纳米磁性微球Fe3O4；所述包埋剂为正硅酸乙酯；（3）纳米微球的功能化修饰：按0.2～0.8 : 200 g/mL的固液比计，将步骤（2）所得包裹后的纳米磁性微球Fe3O4超声分散于甲醇中，再按包裹后的纳米磁性微球Fe3O4与N‑异丙基丙烯酰胺的质量比为0.2～0.8 : 4.05加入N‑异丙基丙烯酰胺，按包裹后的纳米磁性微球Fe3O4与偶氮二异丁腈的质量比为0.2～0.8 : 0.15加入偶氮二异丁腈，得到反应体系，然后将反应体系置于氮气保护下以70℃反应12h，后将反应物置于沉淀剂中进行反复沉淀，直到无沉淀析出；将所得沉淀物进行真空干燥，即得到交联固定脂肪酶的超顺磁载体。