[发明专利]一种固液结合制备利拉鲁肽的方法

摘要

本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种采用固液相结合的化学方法制备利拉鲁肽的方法，本发明能够简化利拉鲁肽的制备工艺，提高终产品的质量标准；本发明首次合成二肽单体Fmoc‑Lys(N‑ε‑(γ‑Glu(N‑Boc)‑OtBu)‑OH,并将其用于利拉鲁肽的制备，同时采用Fmoc‑Ala‑Ala‑OH参与制备利拉鲁肽，避免了24位或25位缺失Ala杂质肽的生成，降低了纯化难度，提高了收率；三氟乙酰化的利拉鲁肽(未修饰)水溶性较好，利于反相色谱纯化制备，同时还保护了N端的氨基在棕榈酸修饰过程中不发生副反应，极大的提高了终产品的收率；本发明的实施，解决了化学合成利拉鲁肽过程中终产品相关杂质肽超标、总收率低的难题，得到纯度大于99.5%，单杂小于0.1%的终产品，降低了生产成本。

主权项

1.一种固液结合制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)Boc‑Glu(OSu)‑OtBu和Fmoc‑Lys‑OH在碱性溶液下偶联生成二肽单体Fmoc‑Lys(N‑ε‑(γ‑Glu(N‑α‑Boc)‑OtBu)‑OH；具体操作为：将Fmoc‑Lys‑OH或其盐与碱A按照摩尔比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20％体积的有机溶剂B助溶，待完全溶解后，以Fmoc‑Lys‑OH的量计，搅拌下滴加入1～1.2倍摩尔量Boc‑Glu(OSu)‑OtBu的有机溶剂B溶液；继续搅拌反应，TLC监测反应终点，反应结束后，减压蒸掉有机溶剂，加入10％柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得Fmoc‑Lys(N‑ε‑(γ‑Glu(N‑α‑Boc)‑OtBu)‑OH；(b)以Wang树脂或CTC树脂为固相载体，采用Fmoc化学保护策略，按照利拉鲁肽肽序，依次与Fmoc保护氨基酸合成N端三氟乙酰化的全保护肽树脂，其中Fmoc保护氨基酸26位Lys采用的是单体Fmoc‑Lys(N‑ε‑(γ‑Glu(N‑α‑Boc)‑OtBu)‑OH，24位和25位采用Fmoc‑Ala‑Ala‑OH，其他位点均采用常规的Fmoc保护氨基酸偶联；N端三氟乙酰化的全保护肽树脂结构如下：Tfa‑His(Trt)‑Ala‑Glu(OtBu)‑Gly‑Thr(tBu)‑Phe‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Asp(OtBu)‑Val‑Ser(tBu)‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑Leu‑Glu(OtBu)‑Gly‑Gln(Trt)‑Ala‑Ala‑Lys(N‑ε‑(γ‑Glu(N‑α‑Boc)‑OtBu)‑Glu(OtBu)‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp(Boc)‑Leu‑Val‑Arg(Pbf)‑Gly‑Arg(Pbf)‑Gly‑树脂；(c)用裂解试剂裂解肽树脂得到三氟乙酰化的未修饰的利拉鲁肽，并经纯化，得到精肽：Tfa‑His‑Ala‑Glu‑Gly‑Thr‑Phe‑Thr‑Ser‑Asp‑Val‑Ser‑Ser‑Tyr‑Leu‑Glu‑Gly‑Gln‑Ala‑Ala‑Lys(γ‑Glu‑OH)‑Glu‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp‑Leu‑Val‑Arg‑Gly‑Arg‑Gly‑OH；(d)在碱性条件下，Pal‑OSu与步骤(c)所得三氟乙酰化的未修饰的利拉鲁肽精肽发生偶联反应，得到棕榈酸修饰的产物；(e)经碱解、纯化、冻干得到利拉鲁肽；所述碱A为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾、三乙胺、二乙胺、N‑乙基二异丙基胺、N,N‑二异丙基乙胺等中的一种；所述有机溶剂B为四氢呋喃、二氧六环、N,N‑二甲基甲酰胺、丙酮、N‑甲基‑2‑吡咯烷酮、乙腈中的一种或一种以上的混合液。