[发明专利]一种转基因西瓜植株的制备方法

摘要

本发明提供了一种转基因西瓜植株的制备方法，属于转基因植物制备领域。该方法是利用转入外源基因的农杆菌侵染西瓜成熟子叶外植体；之后转入共培养基上培养，所述共培养基是由3层无菌滤纸和适量的液体共培养基组成；之后外植体转入筛选培养基，前期使用较低浓度的筛选剂，后期逐渐提高筛选剂浓度，经过芽伸长筛选、生根、炼苗、移栽，得到转入外源基因的西瓜植株，分子鉴定结果显示外源基因成功转入并能稳定表达。本发明方法提高外植体细胞活力，转化细胞数目多，转化细胞与再生细胞重叠性好，逃逸体频率低，转化率高，转基因植株生长健壮，生根好，驯化存活率高，适用于不同外源基因及农杆菌菌株类型转化，且重复性良好，具有良好的经济价值。

主权项

一种转基因西瓜植株的制备方法，包括以下步骤：(1)含外源目的基因的农杆菌菌液侵染西瓜成熟子叶外植体；所述西瓜成熟子叶外植体获得方法为：取健康饱满的西瓜种子，剥去种皮，避免伤及种仁，用70％乙醇溶液消毒30sec，无菌水清洗；有效氯浓度为0.2％‑0.3％的次氯酸钠溶液消毒10‑15min，无菌水清洗后接入BM培养基，28℃暗培养3天，切取健康萌动的种仁，自子叶近轴端，1.5mm×1.5mm切片，及时接入MS液体培养基中；侵染方法为将OD600为0.8‑1.0的含外源基因的农杆菌菌液与西瓜成熟子叶外植体混匀，侵染10min；(2)侵染后，将外植体转入共培养基中，在28℃黑暗条件下培养4天，所述共培养基为三层无菌滤纸，加入液体共培养基浸透滤纸；外植体置于滤纸之上共培养；所述液体共培养基的配方为1650mg/L NH4NO3，1900mg/L KNO3，170mg/L KH2P04，370mg/L MgSO4.7H2O，332mg/L CaCl2，223mg/L MnSO4.4H2O，6.2mg/L H3BO3，8.6mg/L ZnSO4.7H2O，0.83mg/L KI，0.025mg/L Na2MoO4.2H2O，0.025mg/L CuSO4.5H2O，0.025mg/L CoCl2.6H2O，27.8mg/L FeSO4.7H2O 37.3mg/L EDTA.Na2，1000mg/L肌醇，5mg/L烟酸，5mg/LVB1，0.5mg/L VB6，1.5mg/L6‑BA，30g/L蔗糖，pH5.8，高压灭菌；(3)共培养结束后，将步骤(2)的外植体转移到含低浓度筛选剂的筛选培养基上进行筛选培养，之后逐渐提高筛选剂的浓度进行筛选培养，挑选抗性外植体；具体方法为：共培养结束后，选择正常膨大的黄色子叶切片外植体直接转入含3‑3.5mg/L草铵膦和300mg/L羧苄青霉素的筛选培养基，筛选培养2‑3周后，将抗性外植体转入含4.5‑5.5mg/L草铵膦和300mg/L羧苄青霉素的筛选培养基，继续筛选培养2‑3周，当抗性外植体在切口边缘有绿色瘤状愈伤生成并分化出不定芽时，将不定芽切下转入含6.5‑7.5mg/L草铵膦和300mg/L羧苄青霉素的筛选培养基继续培养2‑3周；(4)将抗性外植体幼芽转入芽伸长培养基继续筛选2‑3周，每周继代一次，将不定芽基部残留外植体和瘤状愈伤逐渐切除，使芽与培养基充分接触，取生长良好的完整幼苗，转入生根培养基，幼苗生根后炼苗、移栽，得到转基因西瓜植株。