[发明专利]一种基于固相酶联免疫荧光斑点的肝癌转移诊断试剂盒

摘要

本发明公开了一种基于固相酶联免疫荧光斑点的肝癌诊断试剂盒，利用外周血循环中有功能的肝癌细胞能够主动分泌AFP及EpCAM的特征，通过抗体捕获，然后根据产生的红绿荧光斑点数用荧光显微镜判读结果，可用于检测受检者外周血中是否存在游离、有功能的肝癌细胞，用于肝癌转移复发的提前预警。

主权项

一种基于固相酶联免疫荧光斑点的肝癌诊断试剂盒，其特征在于：包括96孔板、捕获抗体、荧光标记的检测抗体、二抗、荧光防淬灭剂、CD45+磁珠及分选器、牛血清白蛋白组成；所述的捕获抗体为兔抗人AFP和EpCAM捕获抗体；所述的荧光标记的检测抗体为FITC标记的AFP捕获抗体检测抗体和Biotin标记的EpCAM捕获抗体检测抗体；所述的二抗为抗‑FITC‑490及SA‑550抗体；具体操作步骤如下：1)捕获抗体预包被96孔板中加入1∶60稀释的AFP及EpCAM抗体100μL/孔，加盖37℃孵育1‑2h或4℃过夜，弃包被液，用无菌的磷酸盐缓冲液洗板，每孔加200μL含牛血清白蛋白的PBS，加盖，37℃孵育1‑2h，弃上清液，将板直接用于检测；2)采集血液样本，并分离得到含循环肿瘤细胞的细胞群；3)检测包被的96孔板中，待检测孔加100μL细胞悬液，阴性对照孔加100μL 1640培养液，阳性对照孔加100μL含1×104/mL的肝癌细胞株HepG2；4)将96孔板放入湿润的培养箱在37℃、5％CO2培养18‑24h，弃上清液，用含0.1％Tween的PBS洗板；5)每个孔中加入100μL用1％BSA的PBS稀释的荧光素标记AFP及EpCAM检测抗体，置37℃孵育1‑2小时；6)孵育后用PBS洗3次，3min/次，洗板后甩干，加入100μL用PBS 1∶1000倍稀释的抗‑FITC‑490及SA‑550抗体(二抗)，置37℃孵育2小时；7)每孔加入50μL荧光防淬灭剂，放置于室温闭光显色；8)弃去荧光淬灭剂，将96孔板自然晾干；9)计数每个反应空孔中红绿重合斑点的个数，判断结果。