[发明专利]一种新型利用聚合酶链反应体外表达蛋白的方法在审
| 申请号： | 201510383649.0 | 申请日： | 2015-07-02 |
| 公开（公告）号： | CN105018530A | 公开（公告）日： | 2015-11-04 |
| 发明（设计）人： | 徐东昕;邓林红 | 申请（专利权）人： | 邓林红;徐东昕 |
| 主分类号： | C12N15/87 | 分类号： | C12N15/87;C12R1/19 |
| 代理公司： | 常州市维益专利事务所 32211 | 代理人： | 王凌霄 |
| 地址： | 加拿大安大略省士嘉*** | 国省代码： | 加拿大;CA |
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| 摘要： | 本发明涉及一种新型利用聚合酶链反应体外表达蛋白的方法，包括以下步骤：使用基因特异性引物组，用PCR扩增每一个潜在的开放阅读框；第二轮PCR反应在5'端引入了T7噬菌体启动子，在3'端引入T7噬菌体终止子，使用一个通用引物组扩增，得到的PCR产物含有组氨酸标签和T7噬菌体启动子片段和T7终止子片段的DNA；在无细胞反应体系中加入细菌提取物，进行体外蛋白质合成反应，随后采用磁珠法进行蛋白质纯化。本发明的有益效果是：通过PCR给基因增加T7噬菌体启动子和终止子，使其可以在体外成为蛋白质的表达片段。该方法可以快速、高通量表达体外重组蛋白，尤其适合有毒蛋白。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 新型 利用 聚合 反应 体外 表达 蛋白 方法 | ||
【主权项】：
一种新型利用聚合酶链反应体外表达蛋白的方法，其特征是：包括以下步骤：(1)第一轮PCR反应：使用基因特异性引物组，用PCR扩增每一个潜在的开放阅读框；(2)第二轮PCR反应：使用一个通用引物组扩增，在第二轮PCR反应中5'端引入了噬菌体T7启动子，在3'端引入噬菌体T7终止子，步骤(1)得到的PCR产物经第二步PCR后引入组氨酸和T7噬菌体启动子和终止子片段；(3)蛋白质合成：步骤(2)的PCR产物纯化后，添加大肠杆菌细胞提取物，并加入T7 RNA聚合酶，在30℃过夜，进行无细胞体外蛋白质合成反应；(4)蛋白质纯化：组氨酸标记的蛋白是用镍涂覆的磁珠进行纯化。
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