[发明专利]一种汞‑IgE螯合物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种汞‑IgE螯合物及其制备方法和应用，该汞‑IgE螯合物是汞离子与IgE通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。本发明建立了汞‑IgE螯合物的定性定量检测方法，以便定量检测汞‑IgE螯合物在评价一个地区汞污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中汞‑IgE螯合物可以间接反映这个地区人群受汞污染的情况，从而间接反映这个地区汞污染程度。本发明建立的汞‑IgE螯合物定量检测方法其准确度大大提高，并且使检测的重复性得到大大提高。

主权项

一种汞‑IgE螯合物，其特征在于，汞离子与IgE通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成；所述汞‑IgE螯合物的制备方法，包括以下步骤：A）汞与IgE的螯合反应：在提纯源于人体的IgE或按照生物学方法重组的IgE中加入汞离子进行螯合反应，得到反应溶液；所述步骤A）具体如下：1）透析袋的处理：将透析袋放入500mL的EDTA‑NaHCO3混合溶液中，煮沸10min；倾弃EDTA/NaHCO3液，用超纯水轻轻漂洗，再用500mL的 5mmol/L EDTA溶液煮沸10min；弃掉煮沸液，用超纯水彻底清洗，加入超纯水浸泡透析袋4℃过夜；使用时，戴上手套，取出透析袋，用超纯水彻底冲洗其内外表面；2）取2.0mg ITCBE溶于2mL DMSO中；3）取4.0mg IgE溶于4.0mL硼酸盐缓冲溶液中；4）缓慢将步骤2）配制的液体加入步骤3）配制的IgE溶液中，边滴加边震荡，置于温度为25℃，转速为100r/min的摇床中反应24h，然后用透析袋透析24h，除去未与IgE结合的ITCBE；5）将步骤4）所得的液体用1mol/L HCl调节pH值至7.0，然后缓慢逐渐滴加80μl的 1mmol/L 汞离子溶液，边滴加边振荡，以免汞离子使蛋白变性沉淀；6）将步骤5）所得的溶液置于温度为25℃，转速为100r/min的摇床中反应2h，用透析袋进行透析24h；7）将步骤6）透析后的液体于‑20℃分装保存，得到反应溶液；B）纯化汞‑IgE螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应的IgE以及多余的汞离子，即得汞‑IgE螯合物；所述步骤B）具体如下：（1）溶解样品：向经过步骤A）得到的反应溶液中加入生理盐水使汞‑IgE螯合物复溶；（2）平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与IgE特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；（3）上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1）中样品，然后上柱，IgE与填料特异性结合；（4）洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.05‑0.1mol/L的磷酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅰ；（5）收集：收集洗脱液Ⅰ；（6）透析：将步骤（5）中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本；（7）平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能与汞特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；（8）上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（6）中样本，然后上柱；（9）洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.5‑1.0mol/L的磷酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅱ；（10）收集：收集洗脱液Ⅱ；（11）透析：将步骤（10）中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本，即得汞‑IgE螯合物。