[发明专利]一种薄壳山核桃细胞胚胎组织培养的方法

摘要

本发明公开了一种薄壳山核桃细胞胚胎的发生方法，包括选材、消毒处理、试管芽苗诱导培养、体胚诱导、增殖培养、成熟培养、体胚的萌发一系列操作；在体胚诱导、增殖、成熟、萌发培养的培养基中进行培养。本发明具有繁殖系数高，繁殖时间不受季节限制，取材对母体伤害小，无病虫害困扰，能够保持原植株优良性状，在薄壳山核桃苗木生产及科研中均具有重要的应用价值。

主权项

一种薄壳山核桃细胞胚胎的组织培养方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）选材：选取4年生薄壳山核桃优选单株的当年生萌条，将其剪成5~6cm的带芽小段；（2）对带芽小段外植体进行消毒处理；（3）芽诱导培养：在无菌条件下，将步骤（2）中的外植体用剪刀去除茎段头尾氧化变黑部分，直接种于芽诱导培养基中培养11~20d，分化长成无菌芽苗；所述芽诱导培养基的配方为：WPM基本培养基，附加0.05~0.08mg.L^‑16‑BA、  0.05~0.06mg.L^‑1NAA、25~40g.L^‑1蔗糖、18~21 g.L^‑1蜂胶乳油、11~13 g.L^‑1柠檬酸、6.5~7.0 g.L^‑1卡拉胶，调pH值为5.2~5.4；（4）体胚诱导：将步骤（3）中长成的无菌苗嫩叶接种到体胚诱导培养基中培养15~30d；体胚诱导培养基配方为：MS基本培养基，附加0.16~0.20 mg. L^‑16‑BA、0.2~0.3mg. L‑1NAA、0.08~0.12 mg. L‑12,4‑D、0.05~0.06mg.L‑1  玉米素，25~40g.L‑1蔗糖、9.5~11.0g.L‑1酵母膏、6.5~7.0g.L‑1卡拉胶，调pH值为5.7~5.8；（5）体胚增殖培养：将步骤（4）中诱导产生的体胚，进行增殖培养，20~25d后，体胚迅速增殖呈黄色透明颗粒状；体胚增殖培养基配方为：MS基本培养基，附加1.8~2.0 mg. L‑16‑BA、0.01~0.03 mg. L‑1NAA、25~40g.L‑1蔗糖、6.5~7.0 g.L‑1卡拉胶、0.05~0.08mg. L芸苔素内酯、0.03~0.06mg.L长春碱，调pH值为5.7~5.8；（6）成熟培养：将步骤（5）中增殖获得的体胚，接种于含有成熟培养基的培养瓶中培养32~51d；体胚成熟培养基配方为：MS基本培养基，附加40~60g.L^‑1蔗糖、6.5~7.0 g.L^‑1卡拉胶，调pH值为5.7~5.8；（7）体胚的萌发：将步骤（6）中获得的成熟体胚接种于萌发培养基中培养42~58d进行植株再生；所述体胚萌发培养基配方为：MS基本培养基，附加8~12 g. L^‑1山梨醇、20~30g.L^‑1蔗糖、6.5~7.0 g.L^‑1卡拉胶，调pH值为5.7~5.8 ；所述的MS基本培养基的具体配方如下：硝酸钾KNO3    　　　1900 mg/L硝酸铵NH4NO3      　1650 mg/L磷酸二氢钾KH2PO4      　170 mg/L硫酸镁MgSO4.7H2O     370 mg/L氯化钙CaCl2.2H2O 　　440 mg/L碘化钾KI   　　　　　0.83 mg/L硼酸H3BO3     　　　　6.2 mg/L硫酸锰 MnSO4.4H2O   22.3 mg/L硫酸锌　ZnSO4.7 H2O        8.6 mg/L钼酸钠 Na2MoO4.2 H2O     0.25 mg/L硫酸铜　CuSO4.5 　     0.025 mg/L氯化钴 CoCl2.6 H2O    　　　0.025 mg/L乙二胺四乙酸二钠 Na2.EDTA   37.3 mg/L硫酸亚铁FeSO24.7H2O       27.8 mg/L肌醇     　　　　　　　　　100 mg/L甘氨酸        　　　　　　　2 mg/L盐酸硫胺素VB1     　　　　0.1 mg/L盐酸吡哆醇　VB6 　　　   0.5 mg/L烟酸VPP     　　　　　　　0.5 mg/L羧甲基纤维素钠           0.9 mg/L。