[发明专利]一种高效筛查G蛋白-偶联受体表达的融合基因构建方法

摘要

本发明涉及分子影像学和细胞生物学领域，公开了一种筛查G蛋白-偶联受体GPCR表达的融合基因构建方法，该方法在G蛋白-偶联受体GPCR的前段插入人视紫红质Rhodopsin起始端的33个残基以及相应的蛋白酶切位点，在GPCR的末端插入His（5个残基）或者1D4（9个残基）抗原表位、相应的酶切位点，以及绿色荧光蛋白eGFP，构建Rho33-protease-GPCR-1D4-protease-eGFP；其中Rho33能够有效的引导GPCR插膜，增加功能分子比例，提高蛋白产量；1D4表位用于Western Blot检测和蛋白纯化；eGFP是筛选鉴定的主要指标；酶切位点可以切掉目的蛋白以外部分，维持蛋白功能。本发明有效提高功能蛋白比例，提高蛋白产量，后期通过蛋白酶切可以完全消除融合蛋白的影响，兼具高效，便捷的优点。

主权项

一种筛查G蛋白‑偶联受体GPCR表达的融合基因构建方法，其特征在于该方法是：在G蛋白‑偶联受体GPCR的前段插入人视紫红质Rhodopsin起始端的33个残基以及相应的蛋白酶切位点，在GPCR的末端插入His(5个残基)或者1D4(9个残基)抗原表位、相应的酶切位点，以及绿色荧光蛋白eGFP，构建Rho33‑protease‑GPCR‑1D4‑protease‑eGFP；对于低GC含量(含量≤60％)的GPCR用重叠延伸PCR方式构建，具体包括以下步骤：1).利用PCR构建Rho33‑protease‑GPCR‑1D4‑protease‑eGFP的三个片段：先分别PCR得到片段1：Rho33‑protease、片段2：protease‑GPCR‑1D4‑protease和片段3：protease‑eGFP，电泳并胶回收三个片段；2).利用重叠延伸PCR将三个片段连接在一起组成目的片段，即Rho33‑protease‑GPCR‑1D4‑protease‑eGFP；3).目的片段Rho33‑protease‑GPCR‑1D4‑protease‑eGFP的前后两段分别具有HindIII和BamHI酶切位点，通过双酶切以及T4连接酶构建到表达载体pCDNA4上，转化入Top10感受态细胞，进行质粒扩增，抽提质粒并进行性测序验证；4).基因测序正确后，将质粒瞬转进入HEK293细胞，通过荧光观察即可快速鉴定GPCR是否能够表达；对于高GC含量(含量＞60％)的GPCR用一步基因克隆法方式构建，具体包括以下步骤：1).利用PCR构建Rho33‑protease‑GPCR‑1D4‑protease‑eGFP的前两个片段：先分别PCR得到片段1：Rho33‑protease和片段2：protease‑GPCR‑1D4‑protease，电泳并胶回收两个片段；2).利用重叠延伸PCR将两个片段连接在一起组成目的片段，即得到目的基因的前半段Rho33‑protease‑GPCR‑1D4‑protease片段；3).将载体质粒pCDNA3.1‑eGFP用HindIII和KasI双酶切处理，得到线性化载体pCDNA3.1‑eGFP，将重叠延伸得到的PCR片段与线性化载体片段按照等比例混合，利用一步法基因克隆试剂盒将PCR片段插入载体上；产物直接用于转化Top10感受态细胞，进行质粒扩增，抽提质粒并利用HindIII和BamHI双酶切和T4连接酶将目的片段重构到表达载体pCDNA4上，扩增质粒并进行测序；4).基因测序正确后，将质粒瞬转进入HEK293细胞，通过荧光观察即可快速鉴定GPCR是否能够表达。