[发明专利]一种胎儿游离DNA文库定量的标准品及其制备方法

摘要

本发明公开了一种基于半导体测序法检测胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体检的文库DNA浓度的qPCR定量标准品及其制备方法，属于胎儿非整倍体的无创产前检测范畴，对检测样本的检测浓度进行质量控制。本发明qPCR定量标准品制备方法分为五步(1)接头序列与引物合成(2)模拟胎儿游离DNA的文库制备；(3)文库扩增与纯化；(4)制作文库标准曲线；(5)样本检测本。本发明方法可以快速确定样品文库DNA浓度，为胎儿染色体非整倍体21三体、18三体和13三体无创产前检测的准确性和有效性性提供了保证。

主权项

一种胎儿游离DNA文库定量的标准品的制备方法，其步骤如下：(1)接头序列与引物合成：合成接头序列双链Adapter S1和Adapter S2，并在接头序列上设计qPCR扩增的引物对NIPT‑Library F与NIPT‑Library R，如下：Adapter S1：5′‑CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG‑3′(+)3′‑CCCGGTAGAGTAGGGACGCACAGAGGCTGAGTC‑5′(‑)Adapter S2：5′‑CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT‑3′(+)3′‑CCCGGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA‑5′(‑)NIPT‑Library F：5’‑CCATCTCATCCCTGCGTGTC‑3’NIPT‑Library R：5’‑CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT‑3’(2)模拟胎儿游离DNA的文库制备：提取人类基因组DNA，将其物理超声打断为160bp～200bp的DNA片段；利用T4 DNA连接酶将Adapter S1和Adapter S2序列与160bp～200bp的DNA片段进行连接后，E‑Gel胶回收260bp片段；(3)文库扩增与纯化：利用NIPT‑Library F、NIPT‑Library R引物与高保真DNA聚合酶扩增步骤(2)中回收的DNA片段，继而利用磁珠纯化扩增DNA并溶解于无核酸酶水中；(4)制作文库标准曲线：利用Qubit 2.0定量构建好的文库标准品在测序仪上检测，得到Reads数大于80M后再进行10倍梯度的稀释，经qPCR检测后得到Ct值并建立文库标准曲线；(5)样本检测：待检样本的文库DNA通过文库标准曲线进行浓度确定后用测序仪检测，增加样本之间数据量的均匀性。