[发明专利]肝癌中环状RNA-MET基因及其制备方法和荧光定量PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种肝癌中环状RNA‑MET基因及其表达方法和荧光定量PCR检测方法，该肝癌中环状RNA‑MET基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明通过设计能扩增环状RNA的特异性引物，PCR扩增出来MET基因的环状RNA，通过PCR产物克隆DNA测序的方法测定出来了环状RNA‑MET的准确的环化位点；确定了MET基因客观存在一种由1214个核苷酸组成的环状RNA。本发明通过肝癌中环状RNA‑MET基因的荧光定量PCR检测方法；能够特异性检测肝癌细胞和肝癌临床组织标本中的环状RNA‑MET的存在及表达性差异；本发明可以为肝癌的早期临床诊断提供一种理想的基因检测方法。

主权项

肝癌中环状RNA‑MET基因的非诊断性荧光定量检测方法，其特征在于，该荧光定量检测方法包括以下步骤：1)提取总RNA：提取肝癌细胞或肝癌组织中的总RNA，具体操作如下：(a)肝癌组织取2mg大小的组织块，组织用液氮研磨至粉碎，转移到1.5ml离心管，加入1ml trizol；肝癌细胞取100万个左右的细胞，加入1ml trizol；(b)加入200μL氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置15min；(c)4℃下，12,000g离心15min，溶液分为三层，RNA溶解在水相中，转移水相至另一个新的RNase free EP管；(d)加入1倍体积异丙醇，涡旋充分混匀；(e)4℃下，12,000g离心10min，离心后管底出现RNA沉淀，弃去上清；(f)加入1ml 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，弃去上清；(g)室温晾干，加入20μL DEPC水溶解沉淀；2)除去提取的RNA中残留的基因组DNA：在上述提取的总RNA中加入反应液，于37℃消化30min后，加入0.5μl EDTA，65℃灭活10min除去残留的基因组DNA；3)将RNA逆转录成cDNA：在PCR管中加入上述RNA作为模板、采用随机逆转录引物，在PCR体系中逆转录成cDNA；逆转录的PCR体系为：反应条件为：25℃5min，42℃20min，85℃5min，4℃2min；4)采用荧光定量反应Real‑time PCR试剂盒，配置反应体系，对正常肝脏细胞和肝癌组织标本进行检测；具体检测反应体系如下：其中，上下游引物分别为：上游引物：5'CCAGATTCTGCCGAACCAATG 3'下游引物：5'GCTCCTCTGCACCAAGGTAA 3'；荧光定量PCR反应条件为：95℃5分钟变性；95℃10秒，60℃35秒；40个循环，并在温度60℃‑95℃收集荧光信号然后进行融解曲线分析。