[发明专利]一种干酪乳杆菌降解亚硝酸盐的电子供体蛋白及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种干酪乳杆菌降解亚硝酸盐的电子供体蛋白及其制备方法和应用，具体步骤为：(1)将干酪乳杆菌鼠李糖亚种培养后，制成种子液，并接种至诱导培养基A中，静止诱导培养，得诱导工作发酵剂；(2)将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基B中，静止诱导培养，得含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白培养液；(3)将含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的培养液进行离心，清洗后离心，得菌体；(4)在菌体中加入提电子供体蛋白缓冲液，加入溶菌酶，混匀后破壁，破壁溶液经离心后的上清液为降解亚硝酸盐的电子供体粗蛋白液。粗蛋白液经纯化得到电子供体蛋白。所述电子供体蛋白与亚硝酸盐还原酶的混合液可快速高效降解亚硝酸盐。

主权项

1.一种干酪乳杆菌降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将干酪乳杆菌鼠李糖亚种的冻干粉置于MRS培养基中，于30℃～40℃静止培养18h～36h后，制成种子液；(2)以1％～10％的体积百分比，将种子液接种至诱导培养基A中，于30℃～40℃静止诱导培养18h～24h，得诱导工作发酵剂；所述诱导培养基A配方为：含诱导剂NaNO2浓度为5μg/mL～20μg/mL的MRS培养基；(3)以5％～15％的体积百分比，将诱导工作发酵剂接种至诱导培养基B中，于30℃～40℃静止诱导培养24h～36h，得含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白培养液；所述诱导培养基B配方为：含诱导剂NaNO2浓度为10μg/mL～50μg/mL的MRS培养基；(4)将含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的培养液进行离心，用生理盐水清洗后离心，得含降解亚硝酸盐的电子供体蛋白的菌体；(5)在步骤(4)的菌体中加入提电子供体蛋白缓冲液，使菌体浓度为150mg/mL～400mg/mL，加入溶菌酶，混匀后破壁1h～3h，破壁溶液经离心后的上清液为降解亚硝酸盐的电子供体粗蛋白液；所述电子供体粗蛋白液还经过如下分离纯化步骤：(a)将硫酸铵研成细粉，加入硫酸铵至饱和度为20‑30％，缓慢添加并搅拌，于0‑4℃冰箱放置2‑4h、离心后，收集沉淀溶于HEPES缓冲液；(b)经硫酸铵沉淀后的电子供体粗蛋白液在50mM、pH7.8的HEPES缓冲液透析，每隔1小时换一次缓冲液，直到硫酸铵透析完全；(c)透析后的蛋白液再经过高流速离子型琼脂糖凝胶DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱和Sephadex G‑100葡聚糖凝胶过滤层析中的一种或两种层析，制得降解亚硝酸盐的电子供体蛋白。