[发明专利]人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法

摘要

本发明公开了人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法，包括以下步骤：胎盘标本处理，得处理后的胎盘组织；组织消化，得到细胞悬液；不连续Percoll梯度密度分离，得到滋养细胞和胎盘间充质干细胞；滋养细胞的纯化；胎盘间充质干细胞的进一步分离与培养。本发明采用HyQTase和DNAse I共同消化组织，经密度梯度分离获得大量的细胞纯度和活力都比较理想的滋养细胞和的胎盘间充质干细胞；且去除消化碎片、成纤维细胞和红细胞，并把滋养细胞和胎盘间充质干细胞区分开来，获得的细胞滋养细胞纯度可达90％，胎盘间充质干细胞用差速贴壁法将未贴壁的上层除掉，然后向培养瓶中补加无血清培养基继续培养，纯度也很高。

主权项

人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化方法，其特征在于包括以下步骤：(1)胎盘标本处理，得处理后的胎盘组织，将胎盘组织进行组织消化，得细胞悬液；(2)不连续Percoll梯度密度分离：在50mL离心管中逐层铺入7个密度的Percoll分离液，每个密度5mL，再缓缓加入5mL细胞悬液，使用水平离心机室温下1200g离心20min，小心弃除离心管20mL刻度以上的液体，收集12.5～20.0mL刻度的细胞层和12.5～7.5mL刻度的液体，分别放入不同离心管里，用D‑Hank’s液稀释5倍后，室温下1000g离心15min；(3)滋养细胞的纯化：用含体积分数为10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12、丙酮酸盐、10毫克/升亚硒酸钠胰岛素、2毫克/升乙醇胺和20毫微克/mL的bFGF配制成悬浮液，将密度梯度离心后的滋养细胞进行重悬，用差速贴壁法去除成纤维细胞后计数；(4)胎盘间充质干细胞的进一步分离与培养：用含体积分数为10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12、丙酮酸盐、10毫克/升亚硒酸钠胰岛素、2毫克/升乙醇胺和20毫微克/mL的bFGF、增殖促进剂配制成悬浮液，将密度梯度离心后获得的胎盘间充质干细胞进行重悬，在微重力环境下，依次通过电磁场和声波处理间充质干细胞，计数并接种于75mm的培养瓶，放入37℃、二氧化碳浓度为0.5％的CO2培养箱中培养，2d换液1次，细胞生长至90％融合后，消化并计数细胞，按1∶4比例传代，细胞传代后生长速度较快，细胞形态比较均一，变化形态明显的第2天用100ng/ml的BMP4处理，第3天或4用10ng/ml的BMP4处理，第5天用1ng/ml的BMP4处理，到第6天时，用差速贴壁法将未贴壁的上层除掉，然后向培养瓶中补加无血清培养基继续培养，直到传至第九或十代。