[发明专利]一种溶藻弧菌、副溶血性弧菌及创伤弧菌多重降落PCR检测方法

摘要

本发明提供一种可快速特异检测溶藻弧菌(VA)、副溶血性弧菌(VP)及创伤弧菌(VV)的多重降落PCR检测及方法。它包括：10×PCR缓冲液，MgCl₂，dNTP，Taq DNA聚合酶，创伤弧菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌及16S内参阳性对照DNA，4对特异性引物及增菌所需的碱性蛋白胨水；本发明所建立的多重降落PCR可克服常规培养的耗时长、灵敏度低等问题，具有快速、简便、特异、灵敏度高等特征。可于当天出检测结果报告，可同时检测3种临床常见的海洋性弧菌，对创伤弧菌、副溶血性弧菌及溶藻弧菌的检测下限分别为2×10³CFU/µl、5.3×10⁴CFU/µl、6.6×10⁴CFU/µl。

主权项

一种检测溶藻弧菌、副溶血性弧菌及创伤弧菌多重降落PCR检测方法，其特征在于，由以下步骤制备而成：   取待检样本于0.5ml碱性蛋白胨水中37℃培养6h，取液体300µl ，4000rmp离心，留取沉淀加入50µl无菌水，震荡15秒钟，置100℃沸水中煮沸10min，冰上放置3～5分钟，1,3000转离心5分钟，取上清液约30µl即为DNA提取液；取下列浓度及体积的组分混合成25µl的反应体系：缓冲液     10×PCR              2.5 µl；VA toxR‑F   10 µmol/L          0.2 µl；VAtoxR‑R   10 µmol/L          0.2 µl；VP col –F   10 µmol/L           0.4 µl；VPcol –R   10 µmol/L           0.4 µl；VVvvhA‑F   10 µmol/L          0.4 µl；VVvvhA‑R   10 µmol/L          0.4 µl；16S –F      10 µmol/L             0.4 µl；16S –R      10 µmol/L           0.4 µl；MgCl₂       25 mM              1.5 µl；dNTP        10 mM                 2 µl；Taq DNA聚合酶   5 U/µl        0.2 µl；DNA 模板                            1 µl；ddH2O                                 15µl；进行 PCR循环反应，循环参数如下：94 ℃ 8 min；94 ℃ 40s, 65 ℃ ：每循环降低0.5℃，25 s, 72 ℃ 1 min，20个循环；94 ℃ 40s, 55 ℃ 25s,72 ℃ 1 min,20 个循环；72 ℃ 8 min；电泳检测鉴定：对PCR反应产物进行琼脂糖电泳检测，如电泳图中含有740 bp、598 bp、349 bp和246 bp条带，其中740 bp、349 bp和246 bp分别代表检出创伤弧菌、副溶血性弧菌和溶藻弧菌，598 bp则代表提取出有效的模板；所述 VAtoxR‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述VA toxR‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述 VPcol‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述 VP col‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述 VV vvhA‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述VV vvhA‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述16S内参‑ F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述16S内参‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。