[发明专利]脂质体包裹的真核表达质粒pEGFP-IFNα及用途

摘要

本发明涉及脂质体包裹的真核表达质粒pEGFP-IFNα及用途。脂质体包裹的真核表达质粒pEGFP-IFNα，它是通过以下方法制备的：反转录-PCR扩增-连接到T载体-转化至大肠杆菌-双酶切-回收IFNα片段-插入真核表达载体的多克隆位点-转化大肠杆菌DH5ɑ-抽提质粒-酶切-形成W/O型初乳-得到复乳-除去有机溶剂得到干扰素脂质体混悬液。如图5所示，与对照组相比较，这些基因在4种组织中均被强烈诱导表达，其中大多数ISG基因在24h达到最高水平，在72h内回落到正常水平。这从另一个方面证实脂质体包裹的pEGFP-IFNα抗病毒效果。另外，我们还检测了经脂质体包裹的pEGFP-IFNɑ刺激后草鱼体内EGFP基因的表达，结果显示，在草鱼4种组织中均检测到EGFP，其诱导表达水平显得既快速又显著。

主权项

脂质体包裹的真核表达质粒pEGFP‑IFNα，其特征在于它是通过以下方法制备的：（1）、以草鱼RNA为模板，提取总RNA，用反转录试剂盒进行反转录和PCR扩增，制得扩增产物；（2）、扩增产物纯化，然后再连接到T载体，制得连接产物；（3）、连接产物转化至大肠杆菌DH5ɑ，获得克隆产物；（4）、对克隆产物用XhoⅠ、HindⅢ进行双酶切，酶切产物回收IFNα片段，插入真核表达载体pEGFP‑N1的多克隆位点，转化大肠杆菌DH5ɑ，然后抽提质粒进行酶切；得到重组质粒pET‑IFNα；（5）、卵磷脂和胆固醇溶于氯仿‑乙醚中形成有机相，重组质粒pEGFP‑IFNα用PBS稀释形成内水相，取内水相与有机相混合，以超声波细胞破碎机，乳化混合液，形成W/O型初乳；在搅拌下将初乳缓慢滴加入的吐温‑80的水溶液中，再超声处理，得到复乳，除去有机溶剂，得到干扰素脂质体混悬液；所述反转录试剂盒的引物如下：pEGFP‑IFNγ‑U：CCCTCGAGatgaaaactcaaatgtggacgtapEGFP‑IFNγ‑L：CCAAGCTTtcgtctgttggcaatgcttgc。