[发明专利]一种重组酶复合物及体外同源重组无缝克隆的方法

摘要

本发明涉及一种重组酶复合物，该重组酶复合物来源于大肠杆菌Rec同源重组酶，包括RecE、RecT和Gamma蛋白。本发明还提供了一种体外同源重组无缝克隆的方法，只需将两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合，在该重组酶复合物的催化下，高效率地将目标DNA定向克隆到任意载体的任意位点，克隆阳性率可高达95％以上。本发明的方法尤其适用于DNA大片段的克隆。本发明弥补了传统克隆方法操作繁琐、费时、失败率较高等缺陷，可以为DNA体外重组提供一种快速便捷高效的克隆方法，在细胞学基础研究和工农业生产、医药保健等方面奠定重要的基础。

主权项

1.一种微生物体外同源重组无缝克隆的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤一：制备线性化克隆载体；步骤二：制备插入片段PCR产物，通过在引物5’端引入所述线性化克隆载体的末端同源序列，使得所述插入片段PCR产物的5’端和3’端分别带有和所述线性化克隆载体两个末端对应的完全一致的序列，其中，PCR产物末端同源序列的长度为15bp‑20bp；步骤三：将步骤一中获得的所述线性化克隆载体与步骤二中获得的所述插入片段PCR产物在重组酶复合物的作用下进行重组反应，重组酶复合物来源于大肠杆菌Rec同源重组酶，所述重组酶复合物包括RecE、RecT和Gamma蛋白，所述RecE、所述RecT和所述Gamma蛋白三种重组酶的含量比例为1:1:2；当所述插入片段PCR产物大于等于5kb时，所述线性化克隆载体与所述插入片段PCR产物摩尔比为1:10；当所述插入片段PCR产物小于等于2kb时，所述线性化克隆载体与所述插入片段PCR产物摩尔比为1:2；步骤四：将步骤三中获得的重组产物进行细胞转化，获得转化细胞；步骤五：将步骤四中获得的所述转化细胞进行培养，并进行克隆鉴定，得到经所述克隆鉴定为阳性的重组DNA分子。