[发明专利]热休克蛋白基因启动子和四环素基因启动子控制的多基因表达和沉默系统

摘要

本发明公开了一种热休克蛋白基因启动子和四环素基因启动子控制的多基因表达和沉默系统，同一质粒系统中热休克基因启动子HSPP与四环素基因启动子TETp互不影响，各自独立控制其下游的目的基因或shRNA的表达，既可人为控制单独一个基因或shRNA的表达，也可人为控制两个基因或shRNA共同表达。本发明为多基因特异性协调控制提供了条件，解决了目前采用多质粒共转染方法实现基因共表达所带来的表达效率低的问题，并且采取慢病毒搭载系统可以在难转染的细胞中实现选择性基因或shRNA的高效表达，满足了各种实验的需要，同时提供多基因靶点控制平台，为基因治疗提供更多的可能性。

主权项

一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括HSP70基因启动子、四环素基因启动子、由HSP70基因启动子启动表达的绿色荧光蛋白基因和由四环素基因启动子启动表达的Turbo RFP基因，由以下方法制备：用ClaI和XhoI酶37℃水浴酶切SEQ ID NO.3所示HSP70基因启动子序列和pTRIPZ 载体各5min，回收酶切后的HSP70 基因启动子片段以及载体骨架片段，并将回收后的HSP70 基因启动子片段连接至酶切后的pTRIPZ 质粒骨架片段，16℃连接1h，4℃孵育12h后将连接产物转化至Stbl3感受态细胞，AMP+抗性平板涂板，倒置培养14h，菌落PCR鉴定，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对阳性菌落扩大培养14h，进行质粒提取，经测序鉴定得到pTRIPZ ‑HSP70P载体；用XhoI和MluI37℃水浴酶切SEQ ID NO.6所示绿色荧光蛋白基因序列和pTRIPZ ‑HSP70P载体各10min，回收酶切后的EGFP片段以及载体骨架片段，将回收后的EGFP基因片段连接至酶切后的pTRIPZ ‑HSP70P质粒骨架片段，16℃连接1h，4℃孵育12h，然后将连接产物转化至Stbl3感受态细胞，AMP+抗性平板涂板，倒置培养14h，对单菌落进行菌落PCR鉴定，并将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对阳性菌落扩大培养 14h，提取质粒，经测序鉴定得到pTRIPZ ‑HSP70P‑EGFP载体。