[发明专利]一种利用荧光PCR技术对小鼠的分型鉴定方法

摘要

本发明涉及一种利用荧光PCR技术对小鼠的分型鉴定方法，利用荧光PCR引物，经PCR扩增后将产物与已知片段大小的ROX混合，利用377测序，使用Genemapper软件计算出PCR产物的大小，从而达到鉴定小鼠基因型的目的，即可。本发明简单直接准确的鉴定出Crispr/Cas9敲除的mircoRNA小鼠。

主权项

1.一种利用荧光PCR技术对小鼠的分型鉴定方法，包括：(1)利用Crispr/Cas9系统敲除mircoRNA的C57BL/6J小鼠，得到Founder小鼠；将Founder小鼠与C57BL/6J小鼠杂交，得到F1代小鼠，F1代杂合小鼠得到F2代；其中，mircoRNA为mircoRNA505；(2)分别取上述F1、F2代小鼠尾组织，然后提取DNA；(3)在Crispr/Cas9系统敲除的基因位点区域设计一对PCR引物，且在上游引物的5’端使用FAM荧光修饰，得到荧光引物；其中，引物为：L：5’AAACCAGCAAGTGTTGACGC3’；R：5’CCCTGTTTGTCACTTGCAGA3'；(4)将荧光引物对步骤(2)中的DNA进行PCR扩增，然后将PCR产物与分子内标混合，在测序仪上经过电泳分离，鉴定；其中，在测序仪上经过电泳分离为：在377测序仪上经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，测试仪功率为30W，分离时间为2h；分子内标为携带ROX的已知片段大小的DNA，其中已知片段大小的DNA的片段大小为79、105、131、151；鉴定具体为：将测序仪上电泳分离的结果进行数据采集，然后对采集的数据进行分析，分析PCR产物检测峰的数目及位置，计算出PCR产物大小，进行鉴定；检测峰的数目：单峰为纯合，双峰为杂合；检测峰的位置：峰的位置代表产物片段大小；野生老鼠产物大小为112bp，检测峰位于右侧，为单峰；双敲小鼠产物大小为89bp检测峰位于左侧，为单峰；单敲小鼠产物大小为89bp，左侧峰，112bp为右侧峰，为双峰。