[发明专利]一种可用于低海拔地区之全人工培育冬虫夏草的方法

摘要

本发明公开了一种可用于低海拔地区之全人工培育冬虫夏草的方法，涉及寄主工程、菌种工程、侵染工程和出草工程等多个技术特点，将各个技术有效的结合，各步骤准确无误的实施，最终成功培育出在成分、外观等与野生虫草一致的冬虫夏草。其中菌种准备步骤中新增了子实体催生确认步骤，保证分离出合格的菌种，提高生产效率和产量。此外还采用了特定的养虫方式，保证了虫体培育的世代循环。特别是采用该技术人工培育的冬虫夏草与野生冬虫夏草相比，蛋白质组分相似度比例超过95％，具有广阔的市场应用前景。

主权项

一种可用于低海拔地区之全人工培育冬虫夏草的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)菌种准备：挑选完整新鲜野生虫草，用无菌水冲洗过夜后，在洁净工作台剥开虫体部分，勾取里面菌丝培养，依生长情况，培养90‑120天后，低温、光照的条件在培养基斜面上长出子实体，选择符合要求的子实体进行纯化扩培，经分子鉴定确定为菌种无误后进行生产发酵扩大；(2)寄主工程：1)在野外采集的第一代虫蝙蝠蛾蛹用滤纸保湿培养，羽化为成虫后，经形态鉴定其物种，成虫安排在羽化帐中，羽化帐底部铺腊纸，在蜡纸上放入树枝，以便成虫攀附产卵；产卵后将卵收集，将其放入培养箱中培养，其中采用常规滤纸保湿方法保持卵的湿度，培养温度为12‑15℃，培养时间为28‑40天；培养结束后用无菌水冲洗干净；2)待卵孵化后模拟高山草甸环境饲养幼虫，养虫的基质层以草炭土、泥炭土、沙土、蛭石为主，含水量35‑40％；基质层用于模拟高山环境用腐殖土；用于养虫的外部环境为低温高湿环境，温度约为14℃，空间湿度约为50％，卵期和蛹期及成虫饲养空间湿度为90％；每个养虫盒饲养100条虫；(3)世代循环：按上述方式饲养后的第二年的3‑6月翻开基质，可发现第二代蛹，按雌雄分开饲养，饲养基质层与在前的基质层相同，方便以后进行雌雄配比羽化交尾，养蛹湿度比养虫的湿度大，为60％，空间湿度每天用造雾器喷2次水雾，保持土壤和空间湿度，进行二代虫的饲养，依此方法可进行世代循环；(4)侵染工程：采用下述方法中的任意一种：方法一：用第一步分离确定之菌种进行常规发酵培养，用得到菌丝用300目滤网过滤，将滤网上的菌丝倒在5％的葡萄糖溶液中，用打碎机捣碎，再用100目过滤网过滤，保留滤液作为侵染液，此时的侵染液中含有液体发酵的孢子和菌丝段，拌入养虫基质层第三层沙土层中，利用幼虫食入肠道或者接触表皮气孔达到侵染的目的；方法二：利用人工培养冬虫夏草用针刺侵染装置进行针刺侵染，所述进行针刺侵染针筒的外侧壁上设有针头容纳盒，针筒的头部设有针头，针头上包裹硅胶垫，针头露出硅胶垫的长度为1.3‑1.6mm，针头的直径为0.15‑0.3mm；用发酵液颜色为棕黄色或者黄黑色的发酵菌丝经过300目滤网或者miracloth过滤、将滤网上的菌丝倒在5％的葡萄糖溶液中，用打碎机捣碎，再用两层纱布过滤，收集滤液用低温离心机在4℃下离心30分钟，离心机转速为10000转/分钟；离心后发现离心管底部为菌丝饼状或团状，最上面一层为几乎是纯水，用针头抽取菌丝饼或团之上、纯水层之下的中间层液体，作为针刺侵染液；采用手动的方法，针刺蝙蝠蛾幼虫，针刺时的深度把握，以硅胶垫的头部轻触为准；(5)人工培养出草：侵染后幼虫在第二年2月以后会陆续出现僵死虫，翻开基质收集僵虫，表面用75％酒精快速消毒，编号后栽在与除开饲料层养虫环境相同的基质中，湿度约为50％，放在培养箱中，模拟高山环境，昼夜变温，其中采用日光灯照射8‑9小时，温度控制在15℃‑17℃之间，晚上温度控制在3℃‑4℃之间，无日光灯照射，时间为15‑16小时，待有微微出草时，每天中午采用波长275‑420nm的紫外线照射处理10分钟，培养直至出草到适当高度后取出，即得人工培养的冬虫夏草。