[发明专利]诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱的建立方法

摘要

本发明公开了一种诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱的建立方法，具体步骤为将诱导愈伤组织培养大蒜鳞茎经固相萃取等步骤制备成供试品溶液，在一定条件下进行高效液相色谱分析检测，获得诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物的HPLC指纹图谱。通过对10批次样品的HPLC指纹图谱分析，确定共有特征峰，得到标准指纹图谱。该标准指纹图谱能够为诱导愈伤组织培养大蒜的品种鉴别和生产质量控制提供可靠的依据。本发明操作便捷，稳定性高，特异性强，重现性好，特征峰较多，分析效率高，利用本发明将能对诱导愈伤组织培养大蒜进行真伪鉴别，并能全面、准确、有效的评价其内在品质质量。

主权项

一种诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于包括如下步骤：（1）大蒜蒜酶灭活提取物待测溶液的制备：称取诱导愈伤组织培养大蒜鳞茎20g，加25‑30ml蒸馏水，90℃灭酶1h，破碎研磨，加甲醇定容至50ml，5000×g离心15min，取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤；（2）大蒜蒜酶灭活提取物供试品溶液的制备：C18固相萃取小柱经5ml甲醇、10ml超纯水活化，平衡15min；待测溶液以4ml/min速度过柱，再用5ml超纯水淋洗，低真空抽干；再由5ml甲醇洗脱后，室温下低流速氮气浓缩至0.5‑0.8ml，再以甲醇定容至1ml，经0.45μm微孔滤膜过滤待测；（3）高效液相色谱分析：色谱柱为：Eclipse Plus C18，5μm，4.6×250mm；保护柱为：Eclipse Plus C18 Grd，5μm，4.6×12.5mm；柱温35℃；流动相为甲醇和0.2%甲酸水溶液；采用梯度淋洗方式0→2 min→10 min→20 min，甲醇：60%→60%→80%→80%；二极管阵列检测器检测波长240nm；进样量50μL；在上述条件下分析供试品溶液，得到诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱；（4）重复上述（1）至（3），对10批次诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物建立HPLC指纹图谱，通过比较分析确定了14个共有特征峰，其保留时间分别为：2.178 min、2.756 min、2.946 min、3.382 min、3.823 min、4.712 min、6.511 min、7.088 min、8.021 min、9.143 min、10.639 min、13.107 min、14.973 min、18.391 min，相对标准偏差（RSD）<1%，这些共有特征峰构成了诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC标准指纹图谱。