[发明专利]一种定量检测miRNA的RT-PCR方法

摘要

本发明涉及一种定量检测miRNA的RT‑PCR方法，miRNA加Poly(A)尾和逆转录在同一反应体系中进行,利用S‑Poly(T)引物进行miRNA的逆转录。本发明S‑Poly(T)Plus法中，miRNA的Poly(A)加尾和逆转录将在一个反应体系中同步完成，操作简便，缩短时间，用于合成cDNA的时间至少减少0.5h，具有更高的逆转录效率。本发明结合S/P miRsol RNA法和S‑Poly(T)Plus法，建立了一种非常灵敏、高效、简便、快捷、廉价的从提取到检测的技术体系。该技术体系尤其适合于从miRNA丰度较低的生物体液样本中检测miRNA。

主权项

1.一种定量检测miRNA的RT‑PCR方法，其特征在于，miRNA加Poly(A)尾和逆转录在同一反应体系中进行，利用S‑Poly(T)引物进行miRNA的逆转录；包含以下步骤：S1、加尾逆转录：miRNA加Poly(A)尾和逆转录在一个反应体系中完成，利用S‑Poly(T)引物进行miRNA的逆转录；S2、PCR：以步骤S1中逆转录获得的第一链cDNA为模板进行real‑time PCR定量检测；加尾逆转录的反应体系包含：3±1μL体液总RNA或100±20ng细胞总RNA，1±0.2μL的0.5 μM逆转录引物，1±0.2U的多聚腺苷酸聚合酶，100±20U的鼠白血病逆转录酶，2.5μL的4×反应缓冲液，无RNA酶水补足至10 μL；所述4×反应缓冲液包含200±20mM Tris‑HCl，600±50mM NaCl，40±10mM MgCl2，4±0.5mM ATP，2 ±0.5mM dNTP，pH 8.0；加尾逆转录的反应条件为：37~42℃保温60 min，75℃保温5 min，迅速置于冰上，静置2 min；所述细胞或体液总RNA的提取方法如下：1) 向含1 mL的RNAiso‑Plus的离心管中加入100 μL体液样本或106个细胞，吹打混匀，室温静置5 min；加入200 μL氯仿，盖紧离心管盖，剧烈振荡20 s；室温静置5 min；2)12,000 g，4℃离心15 min；吸取500 μL上清液转移至另一新的离心管中；向移除上清液的离心管中加入与移除上清液等体积的无RNA酶水，混匀，12,000 g，4℃离心15 min；吸取500 μL上清液到另一个新的离心管；3)分别向上述2份上清液中加入糖原溶液，使糖原终浓度为1.875~120 μg/mL，再加入与等体积的异丙醇，上下颠倒充分混匀，‑20℃或‑80℃静置至少10 min；4)13,500 g，4℃离心10 min；弃去上清液，向沉淀中加入1 mL的75%乙醇，轻轻颠倒清洗沉淀；13,500 g，4℃离心5 min，完全弃去上清；5) 沉淀在室温下干燥2~3 min，加入20 μL无RNA酶水溶解。