[发明专利]毛竹原生质体培养的方法

摘要

本发明公开了毛竹Phyllostachys edulis原生质体培养的方法，它是通过对胚性愈伤组织进行酶解，将酶解后获得的原生质体进行过滤、离心和纯化，然后将纯化后的原生质体在适当的培养基上培养，使得原生质体再生细胞壁、形成胚性愈伤组织、并萌发形成再生植株，最后再生植株经过壮苗、炼苗后移栽成活。本发明解决了毛竹原生质体培养的技术难题，为实现毛竹的细胞工程育种提供了技术平台，也为其他竹类植物的相关研究提供了参考。

主权项

毛竹Phyllostachys edulis原生质体培养的方法，其特征包括：胚性愈伤组织的酶解，原生质体的分离与纯化，原生质体的培养，愈伤组织的分化，以及壮苗、炼苗和移栽过程，具体步骤如下：(1)胚性愈伤组织的酶解：选择致密淡黄色的毛竹胚性愈伤组织若干，将其放置在愈伤组织增殖培养基上，26℃暗培养7‑15d，边缘生长出白色较疏松的胚性愈伤组织，愈伤组织增殖培养基是以MS培养基为基础，添加1‑3mg/L的2，4‑D、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白、30g/L的葡萄糖、8g/L的琼脂粉；然后将刚长出的白色较疏松的胚性愈伤组织分离，放入装有酶解液的培养皿中，并将培养皿置于70rpm的摇床上进行避光酶解3‑5h，酶解液由2％的cellulase、1.5％的macerozyme、0.1％的MES、0.7M的manitol、0.1％的CaCl2·2H2O、1％的BSA组成，pH＝5.80(2)原生质体的分离与纯化：将酶解后的溶液用40μm的细胞筛进行过滤，收集过滤液体，在4℃条件下设100‑200g离心10‑15min，小心倒掉上清液，加入4℃预冷的改良MS培养液使原生质体重新悬浮，然后再离心，如此反复3‑4次直至酶解液完全洗净，最后将洗净后的原生质体用4℃预冷的MS培养液悬浮保存；改良MS培养液是以MS培养基为基础，添加10g/L的甘露醇、5g/L的山梨醇、10g/L的葡萄糖、20g/L的蔗糖；(3)原生质体的培养：将原生质体悬浮液小心地吸取混合到原生质体培养基上，调整密度为1‑20×105个/ml，26℃黑暗培养10‑20d，期间每隔24h观测原生质体的生长状况，直至原生质体再生细胞壁，继而形成愈伤组织；原生质体培养基是以MS培养基为基础，添加10g/L的甘露醇、5g/L的山梨醇、100mg/L的抗坏血酸、750mg/L的氯化镁、40mg/L的半胱氨酸，40mg/L的天门冬酰胺、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白、10g/L的葡萄糖、20g/L的蔗糖；(4)愈伤组织的分化：将原生质体再生的愈伤组织转接到分化培养基上，26℃光培养30‑50d，光照时间12h/d，光照强度1000‑1500lux，使愈伤组织分化成苗，形成再生植株；分化培养基是以MS培养基为基础，添加0.5‑2.0mg/L的ZT、0.5‑3.0mg/L的IBA、0.5‑2.0mg/L的NAA、30g/L的麦芽糖、8g/L的琼脂；(5)壮苗、炼苗和移栽：将再生的小植株接种到壮苗培养基上培养30‑50d，开瓶炼苗5‑10d，取出小苗清洗根部的培养基，再用0.1％的高锰酸钾溶液清洗根部，然后将小苗栽植到灭菌的介质中，遮阴散射光培养一个月后，幼苗成活；壮苗培养基是以MS培养基为基础，添加1‑4mg/L的NAA、0.2‑0.5mg/L的TDZ、8g/L的琼脂、30g/L的蔗糖。