[发明专利]酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法

摘要

本发明公开了一种酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法，包括：S1、构建用于生产异丁香酚单加氧酶的酵母菌；S2、将构建的所述酵母菌接种至YPD液体培养基中振荡培养；S3、离心收集菌体，生理盐水洗涤，转入MGY液体培养基中振荡培养；S4、离心收集菌体，生理盐水洗涤，转入MM液体培养基中使OD600>6，振荡培养3‑5天；每天补加甲醇，并用氨水调节pH，得到发酵液；选择性地将所述发酵液离心以收集上清液；S5、按异丁香酚：所述上清液或所述发酵液：缓冲液＝0.1‑0.6g：9‑18mL：9‑18mL加入反应容器中，在20‑30℃下振摇转化12‑48h，得到香兰素。本发明实现采用酵母菌工业化生产香兰素，适用于食品领域等，满足需求，安全。

主权项

1.一种酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、构建用于生产异丁香酚单加氧酶的酵母菌；所述步骤S1包括以下步骤：S1‑1、提取土壤的全基因组DNA；所述土壤含有异丁香酚单加氧酶基因；S1‑2、根据异丁香酚单加氧酶的基因序列，设计简并PCR引物；S1‑3、以所述全基因组DNA为模板，用所述简并PCR引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；S1‑4、将所述PCR扩增产物测序，以获得异丁香酚单加氧酶基因序列；S1‑5、根据所述异丁香酚单加氧酶基因序列，设计包含酶切位点的特异性引物，所述特异性引物包括上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2；S1‑6、以所述全基因组DNA为模板，用所述特异性引物进行PCR扩增，得到大小为1438bp的目标基因SEQ ID NO.3，其5’和3’端分别连接6bp和8bp的酶切位点；S1‑7、将所述目标基因SEQ ID NO.3插入毕赤酵母表达载体pPIC9K的EcoRI和NotI酶切位点之间，得到重组质粒pPIC9K‑IEM；S1‑8、将所述重组质粒pPIC9K‑IEM转化毕赤酵母GS115，得到所述酵母菌；S2、将构建的所述酵母菌接种至YPD液体培养基中，于30℃振荡培养36小时；S3、离心收集菌体，生理盐水洗涤，转入MGY液体培养基中；于30℃振荡培养36小时；S4、离心收集菌体，生理盐水洗涤，转入MM液体培养基中使OD600>6，于30℃振荡培养3天；每天补加甲醇10g/L，并用氨水调节pH至5‑7，得到发酵液；选择性地将所述发酵液离心以收集上清液；S5、按异丁香酚：发酵液或上清液：缓冲液＝0.1‑0.6g：9‑18mL：9‑18mL加入反应容器中，在20‑30℃下振摇转化12‑48h，得到香兰素；所述缓冲液为pH8‑10.4的甘氨酸的NaOH水溶液；所述步骤S5中，在所述反应容器中，还添加DMSO、离子液体及香兰素吸附剂中的至少一种；每0.1‑0.6g异丁香酚中：所述DMSO的加入量≤1mL，所述离子液体的加入量≤200μL，所述香兰素吸附剂的加入量≤0.5g；所述香兰素吸附剂为吸附树脂及壳聚糖膜中的至少一种。