[发明专利]一种基于三重放大技术均相非标检测端粒酶活性的方法

摘要

本发明涉及一种基于三重放大技术均相非标检测端粒酶活性的方法，其是通过将端粒酶延长产物与辅助DNA结合释放出引发DNA，引发DNA能够引发链替代反应，形成发夹H1:H2复合物，在复合物的两个末端能够各自形成G‑四链体，N‑甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)自身荧光信号很弱，嵌插G‑四链体后荧光信号显著增强，通过检测NMM荧光信号的变化，可灵敏的检测端粒酶活性，本发明充分利用链替代反应，无需酶辅助就能够实现信号放大，同时巧妙利用了G‑四链体的形成，构建了无需标记，就能灵敏的检测端粒酶活性的方法，为肿瘤疾病的诊断，治疗，以及关于疾病机理研究提供了新思路，在基于端粒酶的癌症治疗诊断方面有很重要的意义。

主权项

1.一种基于三重放大技术均相非标检测端粒酶活性的方法，所述方法不用于疾病的治疗与诊断，其特征在于由以下步骤组成：（1）将养好的待检细胞裂解提取端粒酶，并与端粒酶底物一起加入端粒酶重复序列扩增缓冲溶液中，30～37℃孵育0.5～2小时，得到待检液体系，其中所述端粒酶底物序列为：AAT CCG TCG AGC AGA GTT；（2）将发夹DNA探针H1、发夹DNA探针H2以及单链A‑DNA和单链T‑DNA分别用浓度为50 mmol/L、pH=7.4且含5 mmol/L MgCl2的三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲溶液稀释成浓度为20μmol/L的H1溶液、H2溶液、A‑DNA溶液以及T‑DNA溶液，其中所述发夹DNA探针H1序列为5’‑GGGATGGGTTAGGGCGGGAATCAGAGGGCGGGATGGGGATTCCCGCCCTAACCCTAACTC‑3’，发夹DNA探针H2序列为5’‑GGGTTGGGCGGGATGGGGATTAGGGTTAGGGCGGGAATCCCCATCCCGCCCTCTGA‑3’，单链A‑DNA序列为5’‑AACCCTAACCCTAACCCTAACTCTGCTC‑3’，单链T‑DNA序列为5’‑GAGTTAGGGTTAGGGCGGGAATC；（3）将步骤（2）配制的A‑DNA溶液与T‑DNA溶液等体积混合，得到AT‑DNA溶液；（4）向浓度为50 mmol/L、pH=7.4且含5 mmol/L MgCl2和5 mmol/L KCl的三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲溶液中加入端粒酶重复序列扩增缓冲溶液，混匀，向该混合体系中加入步骤（2）H1溶液、H2溶液和步骤（3）制得的AT‑DNA溶液，使最终混合体系中H1、H2、AT‑DNA的浓度分别为150 nmol/L、200nmol/L、50 nmol/L，30～37℃孵育30～60分钟，向体系中再加入浓度为100μmol/L的 N‑甲基卟啉二丙酸Ⅸ溶液，至N‑甲基卟啉二丙酸Ⅸ在体系中的浓度为1μmol/L，按照常规方法测定基底荧光信号值I0；（5）向与步骤（4）等量的浓度为50 mmol/L、pH=7.4且含5 mmol/L MgCl2和5 mmol/L KCl的三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲溶液中加入步骤（1）所配制的待检液，混匀，向该混合体系中加入步骤（2）的H1溶液、H2溶液以及步骤（3）制得的AT‑DNA溶液，使最终的混合体系中H1、H2、AT‑DNA的浓度分别为150 nmol/L、200 nmol/L、50 nmol/L，37℃孵育30～60分钟，向体系中再加入浓度为100μmol/L的 N‑甲基卟啉二丙酸Ⅸ溶液，至体系中N‑甲基卟啉二丙酸Ⅸ的浓度达到1μmol/L，按照常规方法测定其荧光信号值I1；（6）将步骤（5）的荧光信号值I1与步骤（4）的基底荧光信号值I0进行比较，若I0＜I1，则待检细胞中的端粒酶有活性；否则，待检细胞中的端粒酶无活性，从而完成待检细胞中端粒酶的检测。