[发明专利]一种利用内源CRISPR-Cas系统进行原核生物基因组编辑的方法

摘要

本发明一种利用内源CRISPR‑Cas系统进行原核生物基因组编辑的方法。在对含有内源CRISPR‑Cas系统的原核生物进行基因组编辑时，只需构建一个同时携带人工CRISPR簇和供体DNA的编辑质粒，在内源CRISPR系统对基因组发生DNA干涉后通过同源重组达到对基因组的编辑。其最大的优点在于：应用宿主范围广，所有含有内源CRISPR‑Cas系统的细菌和古菌均可操作；可用于多种编辑方式，缺失、插入和点突变等均可操作；更高的编辑效率，筛选阳性率高，背景低；流程简单，时间周期短，大大减轻原核生物基因组编辑的工作量。

主权项

1.含有CRISPR‑Cas系统的原核生物在内源编辑原核生物基因组中的应用；所述的原核生物为含有内源I型或III型CRISPR‑Cas系统，或同时含有内源I型和III型CRISPR‑Cas系统的细菌或古菌；其应用方法包括：1)构建基因组编辑质粒：在原核生物基因组上拟编辑区域选取一段序列作为protospacer即靶标位点，根据protospacer设计两条反向互补的引物，其序列分别为正向引物：5’‑AAAG‑Nn‑3’，反向引物：5’‑TAGC‑N’n‑3’，其中Nn和N’n为反向互补序列，N和N’表示碱基A、T、G或C，n表示protospacer的碱基个数；将上述两条引物退火形成具有粘性末端的双链DNA，即spacer片段；人工CRISPR载体pSe‑Rp经过限制性内切酶BspMI酶切处理，然后与具有粘性末端的spacer片段酶连，得到能产生成熟的crRNA的人工CRISPR质粒；再将包含突变序列和与宿主细胞基因组上靶标位点两端同源的供体DNA片段插入到上述人工CRISPR质粒上，得到基因组编辑质粒；2)突变株的获得：基因组编辑质粒电转入原核生物感受态细胞，质粒上的人工CRISPR簇转录出pre‑crRNA，pre‑crRNA在细胞内被加工成成熟的crRNA；crRNA与细胞内源的CRISPR‑Cas蛋白形成crRNP复合体，通过crRNA与宿主细胞基因组上的目标DNA链配对来识别靶标位点进行切割；质粒上的供体DNA片段与靶标位点两侧序列发生同源重组，进而得到基因组编辑突变株。