[发明专利]一种产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基及应用

摘要

本发明涉及一种产人胰岛素原的毕赤酵母发酵培养基，该培养基配方为：蛋白胨1～20g/L，黄豆粉1～10g/L，85％磷酸13～14ml/L，碳酸钙0.3～0.4g/L，七水硫酸镁7.0～8.0g/L，硫酸铵6～10g/L，氢氧化钾1.5～2.5g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5～6；本发明还包括基于上述培养基利用毕赤酵母产人胰岛素原的发酵方法，利用本方法，人胰岛素原表达量可提高43％，并且大幅减少发酵时间24～42小时，获得了比常规方法更高的产率。

主权项

1.一种利用发酵培养基进行毕赤酵母发酵产人胰岛素原的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)种子液的制备：将保存的毕赤酵母甘油菌种接于含100ml YPD培养基的500ml摇瓶，30℃，250rpm摇床培养19～20h，作为种子液；(2)分批培养发酵：1L种子液接入含19L发酵培养基的50L发酵罐中，起始培养条件为30℃，pH 5.0，转速300rpm，通气量0.5m³/h，随着培养的进行，相应增大转速和通气量，控制溶氧20～30％，培养19～21h；(3)分批甘油补料培养：分批培养结束后，以10ml/h/L的速率流加含12ml/L PTM1溶液的50％甘油5～6h，培养过程中调整转速和通气量控制溶氧20～30％；(4)甲醇诱导培养：分批甘油补料结束后，诱导温度降为25～28℃，诱导pH调为3.25，以3.6ml/h/L的速率流加含12ml/L PTM1溶液的甲醇5～6h后，增大甲醇补料速率为10ml/h/L，直至发酵结束，诱导过程中调整转速和通气量控制溶氧20～30％；(5)取样及发酵结束：甲醇诱导培养开始后，每3～12小时取发酵液样品一次，3000～12000rpm离心5～10min，测定上清液中人胰岛素原表达量，待表达量增加缓慢或减少时，结束发酵；所述发酵培养基的配方为：蛋白胨1～20g/L，黄豆粉1～10g/L，85％磷酸13～14ml/L，碳酸钙0.3～0.4g/L，七水硫酸镁7.0～8.0g/L，硫酸铵6～10g/L，氢氧化钾1.5～2.5g/L，甘油40.0g/L，PTM1溶液4.35ml/L，pH为5～6。