[发明专利]重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法

摘要

本发明公开了一种重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法，属于重组人胰岛素及其类似物的制备领域。本发明将分泌表达的重组人胰岛素前体的发酵上清用阳离子层析柱进行纯化，在层析的洗涤时先后采用两种不同洗涤液进行洗涤，更快速的进行目的蛋白的洗脱，缩短洗脱时间，减少目的蛋白沉淀，同时减少洗脱样品体积；在洗脱时采用pH值7.0‑9.0的洗脱液进行洗脱，洗脱后的产物不需进行换相操作，直接加入胰蛋白酶进行酶切转换，转换效率高。本发明方法操作简单，经过一步离子层析纯化完成对发酵液上清的粗纯化和换相操作，能够将样品纯度从14％提高至95％，且纯化后的样品直接进行酶切，酶切转换效率在95％以上，简化生产工艺，节约成本。

主权项

1.一种重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法，其步骤为：（1）将阳离子离子层析柱用平衡液进行平衡；（2）将分泌表达的重组人胰岛素前体的发酵上清上平衡后的阳离子离子层析柱，依次用平衡液进行平衡、用洗涤液进行洗涤和用洗脱液进行洗脱；收集洗脱产物，得到纯化的重组人胰岛素前体；（3）将纯化的重组人胰岛素前体用胰蛋白酶进行酶切转换，得到缺少B链第30位苏氨酸的人胰岛素；其特征在于：所述洗脱液为碳酸氢铵缓冲液、硼酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的任意一种；所述洗脱液的浓度为0.05‑0.3 mol/L；所述洗脱液的pH值为7.8‑8.5；步骤（1）或步骤（2）中所述的平衡液由缓冲液和无机盐组成；其中，所述缓冲液为磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或琥珀酸缓冲液中的任意一种；所述无机盐为氯化钠；所述缓冲液的浓度为0.01‑0.2mol/L；所述无机盐的浓度为0.01‑0.12mol/L；所述平衡液的pH值为2.0‑4.5；步骤（2）中所述洗涤为用洗涤液A进行洗涤；用洗涤液A洗涤后，再接着用洗涤液B洗涤阳离子层析柱；所述洗涤液A由缓冲液和无机盐组成；其中，所述缓冲液为磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或琥珀酸缓冲液中的任意一种；所述无机盐为氯化钠；其中，所述缓冲液的浓度为0.01‑0.2mol/L，所述无机盐的浓度为0.01‑0.2mol/L；其中，所述洗涤液B为1‑5mmol/L盐酸；所述洗涤液A或洗涤液B的pH值为2.0‑4.5。