[发明专利]一种兔抗卵转铁蛋白过敏原多克隆抗体的制备方法及其免疫分析方法

摘要

本发明提供了一种兔抗卵转铁蛋白多克隆抗体的制备方法及免疫分析方法，所述制备方法主要过程为卵转铁蛋白兔直接免疫新西兰大耳白兔，经过五次免疫后股动脉取全血，获得卵转铁蛋白抗体血清；通过优化抗体包被量，检测抗体的稀释倍数，封闭液以及样品缓冲溶液的PH值建立卵转铁蛋白间接竞争ELISA方法。本发明制备的抗体效价较高，抑制率较好，建立的方法灵敏度和精密度较好。

主权项

一种兔抗卵转铁蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)抗体制备免疫动物选用雄性西兰大耳白兔，月龄约3个月，体重约1.5公斤，免疫原为卵转铁蛋白，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初次免疫后进行四次加强免疫，加强免疫分别于初次免疫后2周、4周和6周和8周，五次免疫一周后采用股动脉取全血，具体做法是：(1)初次免疫：免疫原与弗氏完全佐剂以1∶1的体积混合，经密封性良好的玻璃注射器乳化充分，直到免疫原与佐剂完全混匀并呈乳白色状态为止，免疫剂量为1mg/只，进行动物免疫；(2)加强免疫：免疫原和弗氏不完全佐剂等体积混合乳化，进行动物免疫，免疫剂量为0.5mg/只；(3)免疫完成时将采集到的血液先在37℃下凝固2h，然后保存于4℃冰箱中过夜，使血块收缩，上清液析出，取上清，‑20℃冰箱保存备用；2)抗体纯化(1)将实验中所需的所有试剂超声20分钟；(2)平衡纯化柱：首先用冲洗管路1‑2h，选用的试剂为pH 7.4的磷酸缓冲液，流速0.5‑1.5mL/min，管路冲洗完毕后取纯化柱，并将封柱用的一部分乙醇溶液慢慢倒出，留下柱高度大约三分之一的乙醇溶液；将纯化柱与蛋白纯化仪连接好，用pH 7.4的磷酸缓冲液冲洗平衡柱子，流速设定为0.5‑1.5mL/min；观察程序屏幕中紫外和电导两条基线为平行线时，即可停止冲柱；(3)上样：取0.5‑1.5mL待纯化的兔抗卵转铁蛋白多克隆抗体血清与磷酸缓冲液等体积稀释，流速设置为0.2‑0.8mL/min，然后将混合液上柱；(4)洗脱：出现杂蛋白峰后，继续用磷酸缓冲液冲洗柱子，至基线达到平衡后停止；用pH 2.7的甘氨酸‑盐酸缓冲液冲洗柱子，流速0.5‑1.5mL/min，此时与Protein A‑Sepharose 4B结合的免疫球蛋白被洗脱下来；(5)收集：加入洗脱液后，当基线开始发生变化时就开始收集洗脱液，每个安道管收集管收集0.5‑1.5mL液体，直至曲线不发生变化，停止收集；收集液经分光光度计280nm处读数，弃去吸光度值＜0.4的收集液，将吸光度值＞0.4的液体混匀后立即用Tris‑HCl迅速调节抗体，使其pH至7.0；(6)处理纯化柱：待抗体纯化结束后，用0.05‑0.2mol/L醋酸迅速冲洗柱子1‑3min，流速3‑8mL/min，然后再用磷酸盐缓冲液平衡柱子，流速1‑8mL/min，同时用pH试纸测定流出缓冲液的pH值，直到其显示中性为止；最后用质量浓度为20％乙醇溶液冲洗纯化柱20min，并使柱子中充满20％乙醇溶液，封存于4℃冰箱中；(7)抗体保存：将纯化后的卵转铁蛋白抗体在4℃环境下用PBS透析三天，透析液为0.01M的PBS溶液，透析液每天换三到四次，透析后的抗体取出后与等体积的丙三醇混匀，分装后于‑20℃冰箱中保存备用。