[发明专利]一种鲜味肽亲和柱的制备方法

摘要

本发明公开了一种鲜味肽亲和柱的制备方法，该方法先合成受体蛋白T1R1、T1R3，再进一步采用蛋白T1R1/T1R3琼脂糖凝胶作为固相载体，载体上的蛋白T1R1/T1R3与鲜味肽相偶联，偶联后的鲜味肽又与固定相化学键合，该亲和柱制备方法简单，可重复使用，提高了纯化效率，从而提高了该方法的灵敏度，理论上可适用于多种样品基质，由于使用了蛋白受体T1R1/T1R3，对于鲜味肽的分离效果良好，偶联的特异性高，吸附量大，可重复多次使用。

主权项

一种鲜味肽亲和柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)用基因重组方法合成T1R1基因和T1R3基因，T1R1的基因序列如SEQ ID NO.1所示，T1R3基因序列如SEQ ID NO.2所示；(2)受体蛋白T1R1、T1R3的制备：将步骤(1)得到的T1R1基因和T1R3基因，分别亚克隆至pcDNA3.1(+)[EF550208.1]载体，并采用哺乳动物细胞进行表达，His纯化，得到受体蛋白T1R1和受体蛋白T1R3。(3)亲和柱的制备(3.1)将12g经溴化氰(CNBr)活化后的琼脂糖干胶悬浮于120mL浓度为1mmol/L的HCl溶液中溶涨，砂芯漏斗中抽洗15min。滤出固体，用蒸馏水反复冲洗至中性，于70℃条件真空干燥8h。(3.2)将步骤2得到的受体蛋白T1R1和T1R3按照质量比1:1混合，溶解于300mL偶联缓冲液中，受体蛋白T1R1的质量分数为2.5％；再加入步骤(3.1)处理后的琼脂糖干胶，在37℃搅拌1h；然后用偶联缓冲液洗去未偶联的受体蛋白，收集偶联的T1R1/T1R3受体蛋白产物；所述偶联缓冲液中含有0.1mol/L的NaHCO₃，0.5mol/L的NaCl，偶联缓冲液的pH为8.3。(3.3)在步骤(3.2)收集的偶联受体蛋白产物中加入5‑10倍蛋白产物体积的0.1mol/L的Tris‑HCl封闭缓冲液(pH 8.0)，室温下振荡反应2h，形成封闭后的偶联受体蛋白产物。(3.4)用约5倍琼脂糖干胶体积的0.1mol/L醋酸缓冲液(pH 4.0，含0.5mol/L NaCl)和约5倍琼脂糖干胶体积的0.1mol/L Tris‑HCl(pH 8.0，含0.5mol/L NaCl)先后交替洗涤步骤(3.3)封闭后的偶联受体蛋白产物。(3.5)用PBS缓冲液(pH 7.4)悬浮步骤(3.4)洗涤后的产物，装入50mm×10mm柱管中，至胶的高度为75mm，用PBS平衡琼脂糖胶，封住口底，冰箱4℃保存，得到鲜味肽亲和柱。