[发明专利]一种用于筛选水稻靶向基因编辑植株的方法

摘要

本发明公开了一种用于筛选水稻靶向基因编辑植株的方法，包括：提取待测水稻植株和对照水稻植株的基因组DNA，加入特异性引物和荧光染料，PCR扩增所提取的基因组DNA中包含编辑位点的DNA片段，然后进行HRM分析，以对照植株所对应的高分辨率熔解曲线为基准线，比较待测植株与对照植株对应的高分辨率熔解曲线的最大荧光差异△F，若|△F|<0.05，判定该待测植株未成功进行编辑；若|△F|≥0.05，判定该待测植株编辑成功。本发明方法操作简便快速、有效、结果准确、高通量、使用成本低。利用本发明的方法辅助育种，能大大提高植株筛选效率。

主权项

一种用于筛选水稻靶向基因编辑植株的方法，其特征在于，包括：(1)以未经编辑的水稻植株为对照植株，以经靶向基因编辑获得的水稻植株为待测植株，分别提取待测植株的基因组DNA和对照植株的基因组DNA；(2)根据与所述靶向基因编辑的靶位点相邻的基因组序列来设计特异性引物，以所提取的基因组DNA为DNA模板，加入所述特异性引物和荧光染料，PCR扩增所提取的基因组DNA中包含编辑位点的DNA片段，所述DNA片段长度为200～500bp；(3)PCR扩增完毕后直接进行高分辨率熔解曲线分析，以对照植株所对应的高分辨率熔解曲线为基准线，比较待测植株所对应的高分辨率熔解曲线与对照植株所对应的高分辨率熔解曲线的最大荧光差异△F，若|△F|<0.05，视为待测植株与对照植株的结果相同，判定该待测植株未成功进行编辑；若|△F|≥0.05，视为待测植株与对照植株的结果不同，判定该待测植株编辑成功；其中，所述的靶向基因编辑是对水稻LOC_Os03g55240基因的CRISPR靶向编辑，所述水稻LOC_Os03g55240基因的序列如SEQ ID NO:1所示，其中第453～471位为编辑位点；此时，所述特异性引物的序列如下：上游引物B1F：5’‑GCACCGCGTCGGCCTCATGT‑3’；下游引物B1R：5’‑CCTGCTTAAACTCCTGGGCTTCCAC‑3’；或者，上游引物B2F：5’‑TCACCGAGCACGACGTGACCTT‑3’；下游引物B2R：5’‑CACGCTGAGGGAGACCTCGAACA‑3’；或者，所述的靶向基因编辑是对水稻大斑基因LOC_Os12g16720的CRISPR靶向编辑，所述水稻大斑基因LOC_Os12g16720的序列如SEQ ID NO:8所示，其中第764～785位为编辑位点；此时，所述特异性引物的序列如下：上游引物T2F:5’‑CGGTGGTGATCTCCAAGCC‑3’；下游引物T2R:5’‑GGGAAGAAGTCGCCGATGGT‑3’。