[发明专利]一种烟曲霉生物膜流动模型

摘要

本发明公开一种烟曲霉生物膜流动模型，包括制备烟曲霉孢子悬液、建立生物膜流动模型和胞外基质染色及CLSM观察生物膜形成。将连接好的流动装置至于37℃恒温培养箱中，泵0.5%次氯酸钠的储液瓶消毒，随后高速流通无菌双蒸水清洗流动装置，灭菌清洗完毕后，连接泵入RPMI-1640培养基，将配制备好的孢子悬液以300μL/channel从chamber上游注入，夹闭两端，倒置2-4小时后开通，菌体表面流速为0.1-0.5mm/s；培养8h、16h、24h、48h、72h后，行胞外基质染色，CLSM观察生物被膜的形态。本发明烟曲霉生物膜流动模型具有无破坏性、实时观察等优点，可模拟植入导管相关感染的情况，是体外过渡到体内研究的研究模型。

主权项

一种烟曲霉生物膜流动模型，其特征在于，包括制备烟曲霉孢子悬液、建立生物膜流动模型和胞外基质染色及CLSM观察生物膜形成；（1）制备烟曲霉孢子悬液：将受试烟曲霉菌株在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，35‑37℃下活化3‑5天，用含0.025% Tween20的PBS缓冲液冲洗斜面收集孢子，用MOPS缓冲后调pH值为6.9‑7.1的RPMI‑1640液体培养基重悬孢子，光学显微镜下用血细胞板计数悬液中的孢子量，用上述RPMI‑1640液体培养基将计数好的孢子悬液稀释，调整孢子终浓度为1‑3×10⁵孢子/ml；（2）建立生物膜流动模型：连接流动装置，所述的流动装置包括蠕动泵，进液储液瓶，硅橡胶管，止水夹，单向排气装置，chamber，废液收集瓶；将连接好的流动装置至于35‑37℃恒温培养箱中，泵0.5%次氯酸钠的储液瓶消毒，随后高速流通无菌双蒸水清洗流动装置，灭菌清洗完毕后，连接泵入RPMI‑1640培养基，将配制备好的孢子悬液以300μL/channel从chamber上游注入，夹闭两端，倒置2‑4小时后开通，菌体表面流速为0.1‑0.5mm/s；培养8h、16h、24h、48h、72h后，行胞外基质染色，CLSM观察生物被膜的形态；（3）胞外基质染色及CLSM观察生物膜形成：无菌生理盐水缓慢清洗chamber中的生物膜，无菌注射器注入300μL制备好的FITC‑ConA染液，37℃避光染色90分钟，泵无菌去离子水洗去多余染液，然后置于CLSM下观察，激发光和滤过光的波长分别为488nm和BP515‑530nm。