[发明专利]耐药性大肠杆菌整合酶整合载体pUC19-attI-400-attC的构建方法

摘要

本发明公开了一种耐药性大肠杆菌整合酶整合载体pUC19-attI-400-attC的构建方法，构建了含有attI和attC重组位点且在attI和attC位点之间间隔440bpDNA序列的重组载体，载体精小，只有3270bp，可以同时进行切割attI和attC位点，也可以单独切开attC位点，载体本身还含有10多种多克隆位点，便于使用者选用适合的限制性内切酶来研究整合酶的作用位点，它带有氨苄抗性，便于筛选，可用于体外检测细菌耐药性整合酶整合活性的载体模型，也可以用来探索其他细菌整合子的整合机制。

主权项

耐药性大肠杆菌整合酶整合载体pUC19‑attl‑400‑attC的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、以440DNA为模板，用以下引物进行PCR扩增，得440bp insertion；F：CGGGATCC AGGGCGAGGAGCTGTTCACC；R：ACGCGTCGAC GTTGTGGCTGTTGTAGTTG；S2、以NCBI报道attI和attC序列为模板，设计特异性引物并加入和载体PUC19具有相同酶切位点和保护性碱基，利用PCR技术扩增整合酶基因重组位点attI和基因盒基因重组位点attC序列片段，然后将重组位点attI和attC序列克隆到载体PUC19上；S3、将步骤S1所得的PCR产物采用DNA Gel Extraction Kit进行纯化后和pUC19载体使用BamHl Sall 37℃C酶切1h，酶切体系如下：PCR产物43μL、载体10μL、10X buffer 5μL、10X buffer 5μL、BamHl1μL、BamHl 1μL、Sall 1μL、Sall 1μL、ddH₂O 33μL；S4、将所得的酶切产物采用DNA Gel Extraction Kit进行纯化后使用Promega T4DNA Ligase室温连接2h，转化DH5alpha感受态，得耐药性大肠杆菌整合酶整合载体pUC19‑attI‑400‑attC；连接体系如下；DNA片段3.5μL、载体1μL、T4 DNA Ligase 0.5MI、10X ligase buffer1μL。