[发明专利]一种高纯人凝血因子IX的制备方法

摘要

本发明一种高纯人凝血因子IX的制备方法，包括冰冻血浆融化后的低温离心；DEAE Sephadex A-50凝胶吸附去冷胶血浆中的凝血因子IX；聚乙二醇去除溶液中杂蛋白；S/D病毒灭活；阴离子交换柱层析得到纯化的凝血因子IX溶液；再上肝素亲和柱进一步层析得到高纯凝血因子IX溶液；超滤、透析、浓缩并加入盐酸精氨酸和甘氨酸作为保护剂；20纳米滤芯过滤去除病毒；冻干；干热病毒灭活。本发明在凝胶吸附、柱层析、超滤透析操作均加入了蛋白保护剂，降低了FIX制品凝血酶激活的概率，提高了产品的合格率；本发明工艺产品得率高，FIX比活可达150IU/mg左右，远高于传统产品，且经三步病毒灭活，产品使用安全可靠。

主权项

一种高纯人凝血因子IX的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1)将新鲜冰冻血浆融浆后离心去除冷沉淀，获得去冷胶血浆，然后将去冷胶血浆加热至10‑15℃；2)将DEAE‑Sephadex A‑50凝胶置于一个不锈钢树脂桶中，先用温度在75～85℃的注射用水充分溶胀，再用10～20℃的注射用水冷却，然后用缓冲液平衡，所述的缓冲液由Na‑citrate和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na‑citrate的浓度为0.005M‑0.015M、NaCL的浓度为0.075M‑0.15M，所述的缓冲液的PH为6.50‑7.50，将上述平衡好的凝胶加入到去冷胶血浆中，按照每升去冷胶血浆加入0.5‑1.5克干凝胶的比例加入平衡好的凝胶，搅拌0.5‑1.5小时，再静置10‑20分钟；3)过滤去冷胶血浆，收集吸附了凝血因子IX的DEAE Sephadex A‑50凝胶，后用洗涤缓冲液冲洗树脂4‑6次，所述的洗涤缓冲液由Na‑citrate和NaCL组成，在所述的洗涤缓冲液中，Na‑citrate的浓度为0.005M‑0.015M、NaCL的浓度为0.1M‑0.25M，所述的洗涤缓冲液的PH为6.50‑7.50，再用洗脱缓冲液洗脱树脂2‑4次，所述的洗脱缓冲液由Na‑citrate、Arginine Hydrochloride和NaCL组成，在所述的洗脱缓冲液中，Na‑citrate的浓度为0.005M‑0.015M、Arginine Hydrochloride的浓度为0.02M、NaCL的浓度为0.5M‑2.0M，所述的洗脱缓冲液的PH为6.50‑7.50，收集洗脱液，然后用0.45μm或1.0μm滤芯过滤洗脱液，收集滤液，即为凝血因子IX粗品溶液；4)在过滤后的洗脱液中加入聚乙二醇，加入后的聚乙二醇在洗脱液中的质量百分比浓度为2‑6％，搅拌0.5‑1.5小时，过滤；5)在上述的滤液中加入Tween80，加入后的Tween80在上述滤液中的质量百分比浓度为1.0％，再加入磷酸三丁酯，加入后的磷酸三丁酯在上述滤液中的质量百分比浓度为0.3％，搅匀后升温至24‑26℃，后保温6～7小时；6)然后降温至5‑15℃，用第一稀释液稀释至电导率不高于15ms/cm，所述的第一稀释液为0.01M Na‑citrate溶液，所述的第一稀释液的PH6.2‑7.20，然后上阴离子交换柱，所述的阴离子交换柱预先用平衡缓冲液充分平衡，所述的平衡缓冲液由Na‑citrate和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na‑citrate的浓度为0.005M‑0.015M、NaCL的浓度为0.1M‑0.15M，所述的平衡缓冲液的PH为6.20‑7.20；再用洗涤缓冲液洗涤，所述的洗涤洗涤缓冲液由Na‑citrate和NaCL组成，在所述的洗涤缓冲液中，Na‑citrate的浓度为0.005M‑0.015M、NaCL的浓度为0.18‑0.3M，所述的洗涤缓冲液的PH为6.20‑7.20，再用洗脱缓冲液洗脱，所述的洗脱缓冲液由Na‑citrate、Arginine Hydrochloride、和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na‑citrate的浓度为0.005M‑0.015M、Arginine Hydrochloride的浓度为0.02M、NaCL的浓度为0.5M‑1.0M，所述的洗脱缓冲液的PH为6.80‑7.80，收集洗脱液即为纯化的凝血因子IX溶液；7)用第二稀释液稀释步骤6)的洗脱液至电导率不高于15ms/cm，所述的第二稀释由Na‑citrate、Arginine Hydrochloride组成，在所述的稀释液中，Na‑citrate的浓度为0.01M、Arginine Hydrochloride的浓度为0.02M，所述的第二稀释液的PH为6.50‑7.50，然后上肝素亲和柱，所述的肝素亲和柱预先用平衡缓冲液充分平衡，所述的平衡缓冲液由Na‑citrate和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na‑citrate的浓度为0.01M‑0.02M、NaCL的浓度为0.1M‑0.15M，所述的平衡缓冲液为PH6.50‑7.50，再用洗涤缓冲液洗涤，所述的洗涤缓冲液由Na‑citrate和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na‑citrate的浓度为0.01M‑0.02M、NaCL的浓度为0.18‑0.25M，所述的洗涤缓冲液的PH为6.50‑7.50，再用洗脱缓冲液洗脱，所述的洗脱缓冲液由Na‑citrate、Arginine Hydrochloride和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na‑citrate的浓度为0.01M‑0.02M、Arginine Hydrochloride的浓度为0.02M、NaCL的浓度为0.4M‑1.0M，所述的洗脱缓冲液的PH为6.50‑7.50，收集洗脱液，用0.45μm或0.22μm滤芯过滤以上洗脱液，所得滤液即为高纯凝血因子IX溶液；8)用10k分子量的超滤膜浓缩以上滤液，然后恒体积透析，再浓缩至凝血因子IX活力高于35IU/ml，得到凝血因子IX浓缩液；9)调节人凝血因子IX含量至20‑30IU/ml，然后调PH值至6.50‑7.50，并加入肝素钠至0.1‑0.4IU/单位FIX，加入盐酸精氨酸和甘氨酸，所述的盐酸精氨酸在凝血因子IX浓缩液中的质量百分比浓度为0.5‑3％，所述的甘氨酸在凝血因子IX浓缩液中的质量百分比浓度为0.5‑3％；10)用20纳米滤芯进行除病毒过滤；11)用0.22μm滤芯对产品进行除菌过滤并分装；12)冻干；13)在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活，得到高纯人凝血因子IX。