[发明专利]一种适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法

摘要

本发明公开一种适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法。本发明通过联合传统蛋白提取的三氯乙酸/丙酮沉淀法和苯酚抽提法，同时引入助溶剂SDS溶液，并优化提取过程，建立了一种适合红树植物秋茄叶片总蛋白提取的Phe‑B方法。本发明有效地提高了蛋白质的提取效率和质量，其技术方案可专门适合于双向电泳的秋茄叶片蛋白的提取。本发明方法具有操作简单、蛋白提取效率高、干扰物质少的特点，适合于蛋白提取困难、蛋白提取效率低、干扰物质多的材料。本发明所提取的秋茄叶片蛋白完全满足双向电泳第一向和第二向的要求，可获得分辨率高、蛋白点清晰、数目较多、分布均匀、背景清楚的高质量双向电泳凝胶图谱，且实验重复性和稳定性好。 1

主权项

1.一种适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、取新鲜秋茄叶片剪碎后，每1g样品加入0.1g的PVPP，于研钵中用液氮充分研磨，将研好的粉末转移至预冷的离心管中；(2)、用TCA/丙酮对步骤(1)离心管中的粉末进行洗涤，每1g样品加入5ml预冷含质量体积比为10％TCA的丙酮，涡旋，充分震荡后离心，弃上清；(3)、用含有0.1M醋酸铵的体积分数为80％甲醇进行洗涤，充分混匀，使溶液pH值达到7以上，离心后去除上清；(4)、加入体积分数为80％丙酮进行洗涤，充分涡旋后直到沉淀完全悬浮，离心后去除上清；(5)、将沉淀真空干燥，以去除残留的丙酮；(6)、提取并沉淀蛋白：每1g样品加入8ml体积比为1:1的苯酚/SDS缓冲液，其中，苯酚的pH值大于等于7.8，充分混匀并孵育，离心，将上层酚相转移到新的离心管，加入5倍体积的含有0.1M醋酸铵的甲醇，沉淀过夜，离心后弃上清，留沉淀；(7)、用甲醇洗涤步骤(6)的沉淀一次，再用体积分数为80％丙酮和纯丙酮各洗涤一次，在每一次洗涤步骤中，都要充分涡旋混匀，然后离心弃上清，留沉淀；(8)、吸干剩余的液体，并将沉淀摊开，真空干燥，得到蛋白干粉；(9)、将步骤(8)得到的蛋白干粉保存备用或进行蛋白裂解：向蛋白干粉中按20μl/mg加入样品裂解液，使蛋白干粉充分浸润、混匀，孵育，期间不时地颠倒混匀，蛋白质充分溶解，离心后所得的上清即为适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白；所述的样品裂解液，其配方为：7M尿素，2M硫脲，质量体积比为4％CHAPS，体积比为0.2％pH值为4‑7的两性电解液，50mM DTT，2mM TBP，0.1mM PMSF。