[发明专利]高产反式-4-羟脯氨酸sucA基因敲除菌的构建

摘要

高产反式-4-羟脯氨酸sucA基因敲除菌的构建。本发明公开了一种利用基因敲除获得反式-4-羟基-L-脯氨酸的生物合成方法。在大肠杆菌BL21(DE3)△putA的基础上敲除基因sucA，打断TCA循环中由α-酮戊二酸生成琥珀酸(由α-酮戊二酸脱氢酶复合体催化的)的过程，同时插入反式-4-羟基-L-脯氨酸羟化酶基因(hyp)，之后转入质粒pUC19-Ptrp2-hyp-vgb。由羟化酶取代α-酮戊二酸脱氢酶的作用，“回补”TCA循环过程，保证TCA循环进行的同时产生羟脯氨酸。本发明还公开了所述重组大肠杆菌在生产反式-4-羟脯氨酸中的应用，摇瓶发酵结果表明，培养基优化后的羟脯氨酸产量为1344.1mg/L，是优化前的5.53倍左右。与同样转入质粒pUC19-Ptrp2-hyp-vgb的原菌相比，在产羟脯氨酸方面具有优势。

主权项

一种生物合成生产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的方法。其特征在于，通过敲除基因sucA(编码α‑酮戊二酸脱氢酶复合体的E1亚基，及α‑酮戊二酸脱羧酶)打断TCA循环中由α‑酮戊二酸到琥珀酸的过程，转化含有色氨酸串联启动子(Ptrp2)、反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸羟化酶基因(hyp)、透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的质粒pUC19‑Ptrp2‑hyp—vgb(之后简称pUHVT4)。L‑脯氨酸在羟化酶的催化作用下，以α‑酮戊二酸为共同底物，生成反式‑4‑羟脯氨酸，同时生成琥珀酸。利用该反应过程的特点，由羟化酶取代α‑酮戊二酸脱氢酶的作用，在脯氨酸羟基化的同时又不影响TCA循环的正常进行。