[发明专利]一种利用多重PCR技术进行SNP-单体型分析的方法

摘要

本发明公开了一种利用多重PCR技术进行SNP-单体型分析的方法，设计的引物在合成时合并为一管进行单引物扩增，同时利用MALBAC技术完成全基因组扩增，在多重PCR扩增时采用touch down PCR扩增程序，并且结合高通量测序以及合理的数据分析，只需一套SNP检测，无需因对象不同而设计不同的方案，缩短工作周期，降低成本。此外，本发明所提供的方法对于家系和胚胎基因组SNP信息进行捕获，能有效、准确的确定胚胎SNP信息，并进行SNP-单体型分析，确定胚胎是否携带遗传基因的突变位点，有效地克服了现有技术成本高、周期长、应用范围小的诸多缺陷。

主权项

一种利用多重PCR技术进行SNP‑单体型分析的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)根据目标区域设计引物(1.1)确定目标基因，根据具体种属，以NCBI官方网站基因序列为参考基因确定目标基因所在染色体的具体位置，从而锁定捕获区域；(1.2)选择SNP区域，界定在目标基因上下游1M范围内，进一步确定SNP区域捕获范围，在SNP位点上下游100bp捕获片段大小为200bp左右，利用引物设计软件或引物专业设计网站进行引物设计，引物设计完成后对引物进行特异性评估，评估合格后进行引物合成；(2)家系样本及胚胎样本的准备(2.1)提取家系中患病个体、父本、母本的外周血样本，获得基因组DNA；(2.2)采集胚胎细胞样本，进行全基因组扩增；(3)多重PCR扩增，对家系及胚胎样本进行目标区域SNP的捕获；(4)采用高通量测序平台，对样本进行测序；(5)数据分析(5.1)将步骤(4)获得的测序结果去掉接头以及低质量数据，采用比对软件比对到参考基因组；(5.2)用软件获得目标区域的SNP，所述软件包括但不限于samtools mpileup，GATK，FreeBayes，VarScan中的至少一种；(5.3)SNP过滤：测序深度最低为100×，等位基因杂合度差异最低为10％，除去潜在错误的SNP；(5.4)筛选区分型SNP，并构建父本和母本SNP‑单体型：同一SNP位点，在父本和母本的4个等位基因碱基中，有1个碱基不同于其他3个即可区分；(5.5)分析SNP‑单体型：胚胎SNP‑单体型有2个，分别遗传自父本和母本各1条，根据区分型SNP和孟德尔遗传原理，判断其SNP‑单体型具体哪个是父源遗传，哪个是母源遗传；(5.6)结果分析：根据步骤(5.4)确定父本和母本SNP‑单体型，区分出与致病位点连锁的单体型，将胚胎所在SNP的具体等位基因对比，根据孟德尔遗传原理，判断胚胎是否携带致病基因位点。