[发明专利]一种单细胞透射电镜制样方法

摘要

本发明公开了单细胞透射电镜制样方法，在常规的常规超薄切片技术的制样基础上，通过对单个细胞进行甲苯胺蓝染液染色和琼脂预包埋，以实现单个细胞的可视化和可操作化；修改优化常规制样流程。本发明方法解决了常规超薄切片样品制样方法无法满足单个细胞进行电镜样品制备，进而无法对单细胞的超微结构进行研究和病理诊断分析的问题。本发明是一种能满足单个细胞电镜样品制备要求，进而能对单个细胞的超微结构进行研究和病理诊断分析的单细胞透射电镜制样方法。

主权项

一种单细胞透射电镜制样方法，其特征是：包括以下步骤：(1)、在体视显微镜下，将单细胞置于装有5‑20微升体积浓度为2.5％的戊二醛的0.2mlEP管中，4℃固定30‑60分钟；(2)、准备一张干净的载玻片，用免疫组化笔在玻片中间画一个直径0.5‑1.5cm的圆圈，干燥10‑15秒，之后将上述包含有单个细胞的液体转移到圆圈正中间；在体视显微镜下检查单细胞是否在载玻片上；(3)、置于室温或37℃烤箱，让液体刚好蒸发完，在体视显微镜镜下，及时加5‑10微升甲苯胺蓝染液，染色1‑3分钟后，用0.1M磷酸盐缓冲溶液(PBS)轻轻洗去染液；(4)、将载玻片置于冰上，滴加30‑60微升融化的质量百分浓度2％琼脂，冷却至50‑60℃后再加，以免损伤细胞形态，进行预包埋；(5)、待琼脂完全凝固后，将包含有单个细胞的琼脂块转移至常规透射电镜制样装置中；用0.1M磷酸盐缓冲溶液漂洗液漂洗3次，每次10‑15分钟；(6)、后固定：用质量百分浓度1％锇酸固定液固定40‑60分钟，然后用0.1M磷酸盐缓冲溶液漂洗液漂洗3次，每次10‑15分钟；(7)、脱水：采用梯度丙酮系列脱水法脱水；30％丙酮10‑15分钟，50％丙酮10‑15分钟，70％丙酮10‑15分钟，90％丙酮10‑15分钟，100％丙酮10‑15分钟，两次；(8)、树脂浸透：用体积比为1：1的纯丙酮和Epon812包埋液的混合液浸泡单个细胞样品，置于37℃烤箱内6‑12小时；再用Epon812包埋液纯包埋液置于37℃烤箱内浸透6‑12小时；(9)、包埋和固化：将Epon812包埋液倒入包埋板孔中，迅速将浸透处理的单个细胞样品摆放在包埋板孔的一端，采用梯度升温聚合固化：37℃烤箱内12‑24小时；60℃烤箱内12‑24小时；(10)、修块及超薄切片：超薄切片机切片，厚度：50‑100nm；(11)、染色：采用质量百分浓度1‑3％醋酸铀染色液和柠檬酸铅染色液对超薄切片进行双染色。